ВВЕДЕНИЕ
Патогенез COVID-19 связан с диспропорциональным ответом иммунной системы. Интерлейкины (ИЛ) играют ключевую роль в развитии «цитокинового шторма», способствуя чрезмерной воспалительной реакции и повреждению тканей [1]. Термин «цитокиновый шторм» относится к избыточному выделению цитокинов, вызванному активацией клеток иммунной системы в ответ на вирусное вторжение [2]. Это явление обостряет течение COVID-19 и приводит к серьезным осложнениям, которые развиваются у пациентов, перенесших как тяжелую, так и бессимптомную форму инфекции; оно сопровождается широким спектром симптомов и состояний, включая сердечно-сосудистые патологии, неврологические и психические расстройства, когнитивные нарушения, патологии со стороны эндокринной системы и т. д.
Ключевыми цитокинами являются ИЛ-6, ИЛ-2R, ИЛ-1β и фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α) [3]. Уровень ИЛ в сыворотке крови значительно выше у тяжелобольных пациентов с COVID-19 по сравнению теми, кто имеют мягкую форму заболевания [4, 5].
Согласно исследованиям, вирус SARS-CoV-2 способен активировать и зрелый ИЛ-1β, что, в свою очередь, может вызвать активацию других противовоспалительных цитокинов в организме [6, 7]. Семейство ИЛ-1, включая ИЛ-1α, ИЛ-1β и ИЛ-18, регулирует иммунные и воспалительные ответы как в инфекционных, так и неинфекционных условиях. Фермент каспаза-1 превращает про-интерлейкин-1β в ИЛ-1β и про-интерлейкин-18 в ИЛ-18 в начале воспалительной реакции [8]. Данные предыдущих исследований позволяют предположить, что уровни ИЛ-2 помогают в оценке прогноза повреждения легких при гриппе типа A [9]. У людей с высоким артериальным давлением, а также с высокими уровнями ИЛ-6 и COVID-19 очень высок риск развития тяжелой дыхательной недостаточности [10]. В работе Adamo S. et al. у пациентов с тяжелым течением COVID-19 наблюдалась потеря незрелых Т-клеток и выявлялись значительно повышенные уровни сывороточного ИЛ-7 по сравнению со здоровыми лицами из контрольной группы и пациентами с легкими симптомами [11]. В другом исследовании была продемонстрирована связь ИЛ-8 с такими осложнениями, как острая почечная недостаточность и респираторная недостаточность, отмечалось снижение отношения PaO2/FiO2 [12]. Также было показано, что пациенты с COVID-19, находящиеся в отделении интенсивной терапии, имеют значительно более высокие сывороточные уровни ИЛ-10 [13–15]. Большое количество исследований в области COVID-19 и постковидных синдромов вносят вклад в изучение составляющих звеньев патогенеза инфекции, вызванной SARS- CoV-2, и ее осложнений. Настоящее исследование фокусируется на изучении уровней ИЛ при COVID-19 в острой фазе и их динамических изменениях в постковидный период.
Цель – изучить динамику уровней ИЛ при COVID-19 с основным акцентом на иммунных ответах во время острой инфекции и их ассоциации с тяжестью заболевания и последствиями постковида.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 294 человека в возрасте 18 лет и старше с подтвержденным COVID- 19, а также 40 контрольных пациентов с отрицательным тестом на SARS-CoV-2, не имевших на момент обследования заболеваний в острой форме. Исследование одобрил локальный этический комитет (референсный номер 01-91/2021 от 22.04.2021) АО «Национальный научный центр сердечно-сосудистой хирургии», все участники предоставили письменное информированное согласие на участие в нем. Все методы проводились в соответствии с руководящими принципами и нормами системы здравоохранения Республики Казахстан.
Данные из электронных медицинских записей, включая демографические данные, клинические особенности, сопутствующие заболевания, инструментальные результаты, показатели жизненно важных функций и лабораторные результаты, были собраны обученным медицинским персоналом больницы (табл.).
Степень тяжести заболевания определялась в соответствии с клиническим протоколом диагностики и лечения COVID-19 у взрослых, утвержденным Минздравом Республики Казахстан 28.01.2022 (протокол № 156) и основанным на рекомендациях Всемирной организации здравоохранения по клиническому ведению пациентов с COVID- 19 и определению его степени тяжести. Тяжесть COVID-19 оценивается на основе клинических симптомов, воспалительных маркеров, функции дыхания, уровня насыщения крови кислородом, результатов рентгенологического обследования, наличия сопутствующих заболеваний, возраста и результатов лабораторных анализов.
Сбор образцов
Профессиональные медицинские работники собрали 1185 сывороточных образцов от пациентов с COVID-19. Образцы для изучения иммунологических параметров были получены на следующих этапах: T0 – 1–3 дня с момента начала заболевания; T1 – 15-й день наблюдения (острая фаза); T2 – 1 мес. наблюдения; T3 – 3 мес. наблюдения; T4 – 6 мес. наблюдения; T5 – 9 мес. наблюдения.
Определение цитокинового профиля
Цитокины/хемокины анализировались в сыворотке крови с использованием набора Milliplex HCYTMAG60PMX41BK (Bedford, MA, США) в соответствии с рекомендациями производителя на системе BioRad Bio-Plex 200 (Hercules, CA, США) в лабораториях ЧУ National Laboratory Astana автономной организации образования «Назарбаев Университет». Сыворотка крови была получена путем центрифугирования в течение 10 мин. при 4000 об./мин. Полученные аликвоты сыворотки хранились при температуре -80 °C для последующего анализа. Согласно протоколу анализа, 25 мкл сыворотки крови были смешаны с антителами, связанными с магнитными бусинами, в планшете на 96 ячеек и инкубировались на ночь при 4 °C с постоянным перемешиванием. Инкубация осуществлялась при комнатной температуре на орбитальной мешалке со скоростью вращения 500–600 об./мин. После инкубации образцы промывали дважды, далее они инкубировались в течение часа при комнатной температуре с биотинилированным детектирующим антителом, далее добавляли стрептавидин-PE на 30 мин. с перемешиванием. Затем планшеты снова промывали, в ячейки добавляли раствор для считывания на приборе Bio-Plex 200.
Статистическая обработка результатов
Все статистические расчеты выполнялись в Python 3 с использованием библиотек NumPy 1.21.5, SciPy 1.7.0, statsmodels 0.13.5 и scikit-posthocs 0.7.0. Визуализация проводилась с использованием библиотек matplotlib 3.7.1, seaborn 0.11.2, и SankeyFlow 0.3.8. Анализ важности признаков осуществлялся с использованием библиотеки scikit-learn 1.2.2.
Все корреляционные тесты и тесты на сравнение групп проводились с применением поправки Бенджамини – Хохберга (FDR) при уровне значимости ≤ 0,05. Корреляционный анализ выполнялся с помощью коэффициента Спирмена для непрерывных переменных, точечно-бисериального коэффициента для смешанных бинарных и непрерывных пар переменных и коэффициента φ для бинарных переменных. Все отрицательные корреляции показаны синим цветом, положительные – красным. Для сравнения 3 или более групп использовался критерий Краскела – Уоллиса с апостериорным сравнением по методу Данна с поправкой на множественное сравнение (FDR).
Анализ важности признаков основывался на расчете среднего уменьшения неоднородности (MDI), где большее значение MDI указывает на более высокую важность. MDI рассчитывался во время поэлементной перекрестной проверки (leave-one-out) посредством алгоритма случайного леса с параметрами по умолчанию (число деревьев = 100, опция balanced для взвешивания классов). Во время перекрестной проверки предварительный или внутренний отбор признаков не проводился.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Динамические изменения профилей ИЛ от острого COVID-19 до пост-COVID по сравнению со здоровой группой
Цитокины играют значительную роль в вирусных инфекциях, регулируя сигнальные пути в клетках. Среди них ИЛ, подкласс цитокинов, сложно модулируют иммунные ответы и механизмы защиты организма хозяина [16].
Наши результаты показали, что уровни ИЛ-1β были ниже у группы пациентов с тяжелой степенью COVID-19 в острой фазе заболевания. Через месяц в группе с умеренными симптомами наблюдалось значительное увеличение, в то время как в группе с легкими симптомами – снижение этого маркера. Интересно, что через 6 мес. после инфекции уровень ИЛ-1β значительно уменьшился во всех группах исследования (т. е. с COVID- 19 различной тяжести), за исключением группы пациентов с чрезвычайно тяжелой степенью, где наблюдалось явное его увеличение. Исследования демонстрируют, что путь ИЛ-1/ИЛ-6 значительно увеличен у пациентов с тяжелыми инфекциями и острым респираторным дистресс-синдромом [17]. Это указывает на то, что блокировка ИЛ-1 способна помочь предотвратить респираторную недостаточность при COVID-19 [18]. Кроме того, Jamilloux Y. et al. обнаружили ИЛ-1β и ИЛ-1Ra в крови и жидкости легких у пациентов с COVID-19-ассоциированной пневмонией [19]. Что касается антагониста ИЛ-1RA, то мы выявили его повышенные уровни во всех группах в острой фазе COVID-19 по сравнению с контрольной (здоровой) группой, но это повышение не достигло статистической значимости. Значительное увеличение ИЛ-1RA отмечалось только через 6 мес., особенно выраженное в группах пациентов с умеренными и тяжелыми симптомами COVID-19. Уровни ИЛ-2 были значительно увеличены у всех групп пациентов во время острой фазы заболевания по сравнению с контрольной группой. В исследовании с участием 60 пациентов с COVID-19 было установлено, что повышенный уровень ИЛ-2 в сыворотке крови коррелирует с продолжительным течением заболевания [5], аналогичные результаты были получены в другом исследовании с 69 пациентами, где высокий уровень ИЛ-2R также ассоциировался с длительной формой болезни [20]. Однако в группе с легкой степенью тяжестью имелась противоположная тенденция – уровень ИЛ-2 при длительном течении болезни снизился. Содержание ИЛ-6 оказалось повышенным через месяц, особенно в группах пациентов со средней и тяжелой степенью тяжести COVID-19. Мы обнаружили, что уровни ИЛ-7 были выше в тяжелых и крайне тяжелых случаях во время острой фазы заболевания по сравнению со группой здоровых лиц. Chi Y. et al. в свою очередь установили, что концентрации ИЛ-7 были выше у тяжелых пациентов по сравнению с другими группами, что указывает на потенциальное использование уровней этого цитокина в качестве биомаркера для измерения тяжести течения COVID-19 [21]. Интересно, что в нашем исследовании через 9 мес. уровень ИЛ-7 снизился при легких случаях болезни, но увеличился при тяжелых. С другой стороны, уровни ИЛ-8 были ниже во всех группах на ранней стадии COVID-19 по сравнению со здоровыми лицами. И даже через 9 мес. концентрация ИЛ-8 не достигла нормального уровня, но еще через месяц она начала медленно повышаться. Это наблюдение дает основания предположить длительное нарушение регуляции уровня ИЛ-8 у пациентов с COVID-19 и, возможно, наличие стойкого воспаления или продолжающихся процессов восстановления тканей после острой фазы заболевания.
В ряде исследований повышенные концентрации ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-10 были ассоциированы со степенью тяжести заболевания COVID-19 [4, 22]. В нашей работе в острой фазе уровни ИЛ-10 были снижены в группах легкой и средней степени тяжести, тогда как в группах тяжелой и крайне тяжелой степенью болезни наблюдалось его повышение по сравнению со здоровой группой. Более того, отмечалась тенденция к снижению содержания ИЛ-10 в течение 9 мес. после инфицирования (рис. 1).
Корреляционный анализ выявил положительную связь между уровнями ИЛ-2 и гипертонией, в то время как между уровнем ИЛ-7 и тем же состоянием наблюдалась отрицательная корреляция. Кроме того, уровень ИЛ-10 продемонстрировал отрицательную корреляцию с наличием штамма вируса омикрон и положительную со штаммом дельта, при этом аналогичные тенденции наблюдались и для содержания ИЛ-8. Кроме того, уровни как ИЛ-10, так и ИЛ-8 имели положительную корреляцию с тяжелым и крайне тяжелым течением COVID-19 и отрицательную – с легким (рис. 2).
Корреляционный анализ позволил установить несколько заметных связей между гематологическими параметрами и тяжестью COVID-19. Так, уровни базофилов и эозинофилов, а также прокальцитонина положительно коррелировали со средней, тяжелой и крайне тяжелой степенью заболевания. Кроме того, содержание гемоглобина положительно коррелировало только с крайне тяжелым течением инфекции, что позволяет предположить его потенциальную значимость в качестве маркера тяжелой формы заболевания. Патогенез COVID-19 сочетает в себе так называемую анемическую гипоксию (низкую концентрацию гемоглобина) с гипоксической гипоксией (низкое насыщение гемоглобина) [23]. Количество лимфоцитов в нашем исследовании прогрессивно возрастало от умеренной до крайне тяжелой формы заболевания. С другой стороны, уровни сегментоядерных нейтрофилов, нейтрофилов и аланинаминотрансферазы показали отрицательную корреляцию с тяжестью заболевания (рис. 3А).
При анализе тепловой карты преимущественно наблюдались отрицательные корреляции уровней ИЛ-5, ИЛ-12 и ИЛ-1β в группах пациентов с легкой и умеренной степенью COVID-19, что указывает на потенциальное снижение концентрации этих цитокинов при менее тяжелых формах заболевания. Напротив, уровни ИЛ-8, ИЛ-10 и ИЛ-12 (p70) продемонстрировали положительную корреляцию со степенью тяжести COVID-19 в группах пациентов с легкой и умеренной тяжестью заболевания, что говорит об их потенциальной активации или повышенной экспрессии при более легких формах этой инфекции (рис. 3B).
Анализ важности признаков перестановки показал, что ИЛ-15 и ИЛ-8 обладают наибольшей диагностической значимостью среди исследованных ИЛ. Кроме того, высокие уровни значимости продемонстрировали ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-17A, ИЛ-1α и ИЛ-10, что подтверждает результаты, полученные с помощью анализа Milliplex (рис. 4).
Инфекция, вызванная SARS-CoV-2, инициирует активацию транскрипционных факторов NF-κB и STAT3, которые индуцируют процесс, известный как ИЛ-6 усилитель (ИЛ-6 Amp) [24]. Этот процесс приводит к усиленной активации NF-κB и последующей гиперпродукции провоспалительных цитокинов и хемокинов. Таким образом, образуется порочный круг, способствующий развитию и поддержанию гипервоспалительного состояния, которое связано с тяжелым течением COVID-19. В свою очередь, ИЛ-6 Amp привлекает иммунные клетки, такие как Т-лимфоциты и макрофаги, что усиливает положительную обратную связь уровня этого маркера с тяжестью заболевания.
Отметим, что увеличение смертности от COVID- 19 с возрастом может быть ассоциировано с усилением активации ИЛ-6 Amp, поскольку ИЛ-6 – важный показатель клеточного старения [25]. Кроме того, к характерным особенностям COVID-19 относят снижение природных механизмов защиты от вирусов и неправильную воспалительную реакцию, свидетельством которой служат низкий уровень интерферонов I и III типа и высокое содержание хемокинов и ИЛ-6 [26]. Такой сниженный или задержанный ответ интерферона I препятствует эффективному устранению вируса и вызывает излишне сильную воспалительную реакцию, ухудшая прогноз для пациента [27] (рис. 5).
Таким образом, наши результаты проливают свет на сложное взаимодействие ИЛ в патогенезе и прогрессировании COVID-19. Выдающееся значение ИЛ-1β и корреляция его уровня с тяжестью заболевания наряду с разнообразными реакциями, в которые вовлечены ИЛ-10, ИЛ-7 и ИЛ-8, демонстрируют многогранный характер регуляции цитокинов при коронавирусной инфекции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Настоящее исследование подчеркивает динамические изменения маркеров воспаления, наблюдаемые на протяжении всего периода лечения COVID-19 и на этапе после выздоровления. Во время острой фазы выработка ИЛ (ИЛ-1α, ИЛ-1β и ИЛ-2) отражает раннюю иммунную активацию, при этом уровень ИЛ-1β заметно снижается в тяжелых случаях. Через 6 мес. после заражения SARS-CoV-2 концентрации ИЛ-1β снизились при всех степенях тяжести инфекции, за исключением когорты пациентов с крайне тяжелой формой COVID-19, что свидетельствует о выраженной динамике изменения уровня цитокинов в зависимости от тяжести заболевания. Более того, в тяжелых случаях заболевания во время острой фазы уровни ИЛ-7 были повышены, что свидетельствовало об усилении иммунного ответа, в то время как уровни ИЛ-8 оставались постоянно нарушенными, потенциально указывая на устойчивое воспаление. Примечательно также, что ИЛ-10 демонстрировал различные уровни экспрессии в группах пациентов с различной тяжестью COVID-19; это подчеркивает сложность регуляции цитокинов при прогрессировании инфекции. Кроме того, уровни ИЛ-10 и ИЛ-8 коррелировали отрицательно с наличием штамма омикрон, но положительно – со штаммом дельта. Уровень ИЛ-2 положительно коррелировал с гипертонией, тогда как ИЛ-7 показал отрицательную корреляцию с этим состоянием. Наконец, концентрации ИЛ-10 и ИЛ-8 продемонстрировали дифференциальную корреляцию с наличием у пациентов штаммов омикрон и дельта, а также с тяжестью заболевания COVID-19. В соответствии с анализом важности признаков перестановки ИЛ-15 и ИЛ-8 оказались наиболее диагностически значимыми ИЛ среди исследованных, что подтверждает наши результаты. Полученные нами результаты могут иметь большое значение для рекомендации целенаправленных мер по смягчению долгосрочных последствий и осложнений, связанных с COVID-19.
