Тканевая инженерия клапанов сердца: новые возможности и перспективы

Традиционные искусственные клапаны сердца

Заболевания сердечно-сосудистой системы — основная причина смертности населения. Значительная их часть представлена пороками сердца. Увеличение числа паци­ентов, нуждающихся в коррекции этих пороков, оцени­вается примерно в 3 раза, возрастая с 290 000 в 2003 г. до более 850 000 к 2050 г. [1].

За последние 30 лет стандартные методы хирургическо­го лечения поражения клапанного аппарата сердца изме­нились незначительно. Протезирование клапанов сердца механическими или биологическими протезами по-пре­жнему остается основным методом лечения больных с поражениями клапанов сердца на конечной стадии.

Механические протезы клапанов в основном изготавли­ваются из пиролитического углерода в сочетании с метал­лическими и полимерными компонентами. Несмотря на прочность, эти устройства имеют ряд недостатков, связанных как с самим клапаном (например, образо­вание тромбов, развитие эндокардита, что происходит преимущественно на поверхности инородных искусст­венных материалов, тромбоэмболических осложнений), так и с необходимостью длительной, пожизненной антикоагулянтной терапии [2]. Примером побочных действий антикоагулянтной терапии служит развитие геморраги­ческих кровотечений, часто возникающих у лиц, ведущих физически активный образ жизни. Большим недостатком механических протезов является отсутствие способности к росту, значительно ограничивающее их использование в хирургии врожденных пороков сердца.

Увеличение числа пациентов старшего возраста в когор­те кардиохирургических больных в западноевропейских странах определило тенденцию к большему использова­нию биологических искусственных клапанов сердца [3]. Разработанные в 60-х годах XX века, как правило живот­ного происхождения, глютаральдегид-фиксированные клапаны стали более надежными в использовании и ком­мерчески доступными в 70-е годы. Срок эксплуатации данных протезов клапанов, изготавливаемых из клапа­нов сердца свиньи или бычьего перикарда, составляет 10—18 лет [4]. Со временем они подвергаются дегенера­ции и кальцифицированию. Через 15 лет после имплан­тации биологических протезов клапанов 65% пациентов в возрасте до 60 лет нуждаются в повторных операциях [5]. Такие биологические искусственные клапаны могут быть рекомендованы для хирургического лечения паци­ентов старше 65 лет, без необходимости пожизненно­го применения антикоагулянтов в послеоперационном периоде [6].

К этой же группе клапанов можно отнести аллотранс­плантаты (также называемые гомографтами), трансплан­тируемые пациенту от донора, и аутотрансплантаты, т.е. полученные из аутологичных тканей пациента [7]. Примером может служить аутографт легочной артерии, используемый при операции Росса. Он обладает пре­восходными гемодинамическими характеристиками, отсутствием необходимости антикоагулянтной тера­пии, достаточной устойчивостью к инфекциям. В случае аллографтов ограниченная долговечность и способность к деградации с возрастом может быть вызвана многи­ми причинами, такими, как иммунный ответ организма или прогрессивное изменение имплантированного алло­трансплантата за счет развития фиброзной ткани. При имплантации кондуита в позицию легочной артерии про­блемой также является возможность аневризматического изменения его в проксимальном отделе или стенозирования дистальной части кондуита.

Пятилетняя состоятельность гомографта после реконс­трукции им выводного тракта правого желудочка у детей до первого года жизни ограничивается 25%, для реци­пиентов от 1 до 10 лет жизни — 61%, а для детей старше 10 лет, она составляет 81% [8]. В дополнение к этому имеются определенные трудности в организации банков гомографтов и в достаточном их обеспечении.

Таким образом, традиционно используемые протезы клапанов сердца не идеальны, причем ни один из их видов не обладает способностью к росту. Обладая последним, искусственные клапаны сердца смогли бы обеспечить детей возможностью обходиться без повторных операций на протяжении последующей жизни [9]. Все это побудило исследователей к поиску новых, альтернативных путей в решении проблем хирургической и интервенционной реконструкции клапанов сердца.

Новый подход к разработке «аутологичных» клапанов сердца предлагает метод тканевой инженерии. Он заклю­чается в создании искусственных клапанов с использова­нием аутологичных клеток и внеклеточного матрикса или искусственных биоактивных материалов, имитирующих натуральный внеклеточный матрикс (рис. 1). Это позво­ляет добиться гистологического строения конструкции, подобного нативному клапану. Четкое представление структуры клапана, а также характерных особенностей типов клеток является необходимым для успешного при­менения принципов тканевой инженерии в создании кла­панов сердца.

Рисунок 1. Трехмерная синтетическая матрица клапана сердца (по [28]).

Тканевая инженерия клапанов сердца

Тканевая инженерия объединяет научные исследова­ния в фундаментальных областях, таких как химия, мате­риаловедение и клеточная биология, с клиническими дисциплинами, такими как хирургия. Потенциальное ее применение в регенеративной медицине распространяет­ся в диапазоне от отдельных структурных тканей (напри­мер, кожи, хрящевых структур, костей) до сложных орга­нов (например, сердца, печени, почек, поджелудочной железы) [10]. Сердечно-сосудистая тканевая инженерия фокусируется на кровеносных сосудах [11—13], миокарде [14, 15] и клапанах сердца [16—18]. Впервые принципы тканевой инженерии с использованием роста аутологич­ных клеток на искусственных 3D матрицах для получения клапанов сердца, были реализованы Т. Shinoka и соавт. в 1995 г. [19]. Этой научной группой из Бостона были использованы искусственные биологически резорбируемые полимеры в качестве матрицы для реконструкции легочного клапана сердца. В результате удалось частично восстановить клеточное и функциональное строение кла­пана. С использованием данной модели было осущест­влено протезирование кондуита легочной артерии [20].

Матрицы

С момента зарождения тканевой инженерии клапанов наметились 2 пути развития исследований по разработ­кам матриц для дальнейшего посева на них клеток. Идеи использования биологически разлагаемых полимерных материалов в качестве матриц были применены J. Vacanti и J. Meyer [9, 10], S. Hoerstrup и соавт. [26—28] и др. Возможность использования биологических матриц под­держали научные группы A. Haverich и соавт. [31—35], M. Yacoub и соавт. [21, 22] и др. Независимо от типа все матрицы должны отвечать следующим требованиям: иметь механическую и биологическую целостность, способство­вать миграции, адсорбции и росту клеток, проводить дина­мические и биохимические сигналы, обеспечивать диф­фузию питательных клеточных компонентов и факторов, иметь динамически изменяемую архитектуру.

Синтетические полимерные матрицы обычно имеют хорошо контролируемые свойства и легко синтезируются (рис. 2). Первые синтетические полимерные матрицы изготовлялись на основе полигликолевой кислоты (PGA) и полилактической кислоты (PLA) [23].

Рисунок 2. Стенка легочного клапана овцы. Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув 400.

А — нативный препарат; Б — после децеллюляризирования.

Эти полиэфиры разлагаются путем гидролиза в чело­веческом организме до молочной кислоты и выделяются с мочой или в результате цикла трикарбоновых кислот [24]. PGA является линейным алифатическим полиэсте­ром, с высокой температурой плавления и низкой рас­творимостью в органических растворителях. В медици­не он был использован в качестве первого полностью рассасывающегося синтетического шовного материала, имеющегося в продаже под торговым названием «Dexon» с 1970 г. Данный материал довольно быстро рассасыва­ется, теряя свои механические свойства через 2—4 нед после имплантации. PLA — сополимер гидрофильного PGA, имеющий более гидрофобные свойства. В связи со сниженной скоростью гидролиза (преобладающего способа биодеградации) он является материалом с более широким спектром применения. Данные вещества счита­ются безопасными, нетоксичными и биосовместимыми, что позволяет успешно использовать их в производстве медицинских имплантатов [25]. Однако использование подобных алифатических полиэстеров в качестве каркас­ных моделей клапанов сопряжено с повышенным обра­зованием фиброзной ткани, что приводило впоследствии к несостоятельности створок клапана.

Улучшение свойств матриц было достигнуто с помо­щью полигидроксиалканоатов (PHAs). R. Sodian и соавт. использовали PHAsи поли-4-гидроксибутират (P4HB) при разработке матрицы [26, 27]. Преимущества этих термопластичных полиэфиров при создании клапана должны были повлиять на процесс отливки трехстворча­той матрицы клапана. Однако выявленные впоследствии недостатки заключались в более продолжительном пери­оде биодеградации материала in vivo. Исследования пока­зали длительную персистенцию матрицы с замедленным замещением ее аутологичными тканями в организме, что могло приводить к побочным эффектам.

S. Hoerstrup и соавт. совместили пористые свойства PGA и термоустойчивость P4HB в создании трехмерной целостной конструкции трехстворчатого клапана. После 20 нед имплантации данного клапана показано отсутс­твие деградации створок и образования тромбов на их поверхностях [28].

В настоящее время ограничение использования син­тетических матриц для создания клапанов обусловлено затруднениями в создании целостного кондуита клапана, имеющего трубчатую форму. Стенка нативного клапана является сложной функциональной конструкцией, а не просто трубчатой структурой с наличием синусов, спо­собствующих закрытию створок [29]. Как показывают последние исследования, она во многом влияет на функ­циональность и длительное сохранение клапана как еди­ной структуры, что должно учитываться при разработке новых материалов для создания клапанов [30].

Альтернативой синтетических матриц являются био­логические каркасы клапанов, состоящие из натураль­ных компонентов экстрацеллюлярного матрикса (таких, как коллаген или фибрин) или децеллюляризированных интактных аллографтов или ксенотканей (клапаны сер­дца или подслизистая основа, или субмукоза, тонкой кишки).

Клеточные компоненты, не принимающие участие в миграции и росте аутологичных клеток в экстрацеллюлярном матриксе, должны быть удалены с биологическо­го материала, предшествующего производству матрицы. Кроме того, эти клетки обладают иммунной активностью и могут служить переносчиками заболеваний от донора реципиенту. Данный процесс носит название децеллюля- ризации (рис. 3).

Рисунок 3. Децеллюляризированный клапан овцы после эксплантации. Макроскопическое исследование показывает сохранившуюся состоятельность створок клапана, отсутствие дегенерации, признаков кальцификации и инфекционного поражения.

В нашей лаборатории при клинике кардиоторакальной трансплантологии и сосудистой хирургии Ганноверской высшей медицинской школы были разработаны и актив­но используются методы децеллюляризации на основе детергентов [31]. «Ганноверский метод» включает исполь­зование смеси двух детергентов: додецилсульфата сульфата (SDS) и деоксихолата натрия (SD) [32]. Эффективность удаления клеток из ткани контролируется стандартны­ми методами окрашивания гематоксилином и эозином и анализом клеточного ДНК. Для оценки прочности и функционального статуса таких клапанов сердца были выполнены серии имплантаций на овцах [33] (рис. 3). I. Tudorache и соавт. для изучения механофизических характеристик были проведены различные биомехани­ческие тесты [34]. Оценивались образцы легочного клапа­на для оценки структурной жесткости, предела прочнос­ти, конечной деформации и модуля упругости (модуль Юнга). Растяжимость образцов проверялась с помощью бесконтактного лазерного микрометра. J. Zhou и соавт., сравнив несколько способов децеллюляризации свиных клапанов, показали, что деоксихолат натрия является оптимальным детергентом для удаления клеток и презер­вации матрикса [36].

В некоторых лабораториях для децеллюляризации био­логических матриц используют ферментативную обработ­ку материала такими ферментами, как протеазы и нуклеазы. Наиболее часто используемым протеолитическим ферментом, разрушающим пептидные связи, является трипсин. Однако ряд исследователей показали отрица­тельное влияние данного метода на экстрацеллюлярные компоненты [37].

Децеллюляризированная субмукоза тонкой кишки сви­ней (SIS) была хорошо изучена в качестве природного материала для матриц и также может быть использована в производстве клапанов. При имплантации было отме­чено быстрое ее ремоделирование в донорскую ткань. Данные свойства позволяют широко использовать SIS в тканевой инженерии миокарда, например, при реконс­трукции постинфарктного рубца левого желудочка [38].

Основываясь на нашем собственном опыте, а также на результатах, полученных в других исследовательских центрах, мы считаем биологические матрицы наибо­лее подходящими для тканевой инженерии клапанов. Разработанные протоколы децеллюляризации позволяют успешно уменьшать иммуногенность и риск кальцифи­кации будущих клапанов, при этом создавая основу для заселения аутогенных или эндогенных циркулирующих клеток. Децеллюляризированные аллотрансплантаты и ксенобиологические материалы лучше всех могут слу­жить в качестве матриц, сохраняя многие механические и структурные свойства биологической ткани, такие как прочность на растяжение и уникальный состав экстрацеллюлярного матрикса. Кроме того, важной является возможность их «щадящей» стерилизации перед клини­ческим применением.

Клетки, используемые в тканевой инженерии

В настоящее время существует большое количест­во клеток, нашедших применение в области тканевой инженерии клапанов сердца [39]. Широко использу­ются клетки сосудистого происхождения (артериаль­ного и венозного), которые были успешно применены для разработки клапанов сердца и миокарда в опытах на животных [35, 40].

Прогрессу тканевой инженерии клапанов сердца в пос­ледние годы способствуют исследования стволовых кле­ток. Уникальные их свойства, такие как мультипотентность и способность к самообновлению, делают стволо­вые клетки привлекательными для тканевой инженерии.

Эндотелиальные клетки-предшественники (ЭКП) являются гемопоэтическими стволовыми клетками кост­ного мозга, способными дифференцироваться в эндоте­лиальные клетки кровеносных сосудов и клапанов сер­дца. ЭКП способны поддерживать сосудистый гомео­стаз путем реэндотелиализации после травм эндотелия и неоваскуляризации после ишемического поврежде­ния тканей. Впервые популяция ЭКП была изолирована из мононуклеарной фракции циркулирующих клеток крови в 1997 г. T. Asahara и соавт. [41]. Эти клетки харак­теризуются экспрессией ряда специфичных для незрелых клеток-предшественников и зрелого эндотелия поверх­ностных клеточных маркеров (CD34, CD133, рецепторов 2-го типа к фактору роста сосудистого эндотелия — VEGF-R2 и др.). Помимо периферической крови, ЭКП могут быть получены из костного мозга и пуповинной крови. Простота забора биоматериала и культивирования in vitro с последующей дифференцировкой клеток позво­ляет избежать использования интактных сосудов [42, 43].

После выделения стволовых клеток их культивируют и при получении необходимого количества их засеивают на матрицы будущих клапанов. В дальнейшем стимуля­ция клеточного роста происходит в биореакторе.

Биореактор

Механическая стимуляция тканей in vitroв условиях биореактора широко используется в сердечно-сосудис­той тканевой инженерии для улучшения формирования, организации и функции тканевых структур. Биореактор обеспечивает растущим тканям механическое кондицио­нирование, главным образом за счет циклического пото­ка и изменения давления, которые имитируют физиоло­гические условия (рис. 4). Биореакторы были специаль­но разработаны для создания условий потока жидкости и давления — основных сигналов в тканевой инженерии кровеносных сосудов и клапанов [44—46].

Рисунок 4. Биореактор для кондиционирования тканей. (Фотография из научно-исследовательской лаборатории биотехнологий и искусственных органов, Ганновер, Германия).

Оптимальная схема кондиционирования зависит от многих параметров, таких как чувствительность клеток к механическим сигналам, используемых матриц, переда­чи механических сигналов от матрицы к клеткам, видов механических сигналов.

Кроме того, выделяют так называемый собственный биореактор тела, под которым понимают эндогенную колонизацию клетками матрицы клапана в теле паци­ента. Однако механизмы клеточной дифференцировки при данном виде кондиционирования in vivo до конца неизвестны [47].

Возможности в клинике

P. Dohmen и соавт. описали первую имплантацию полу­ченного методами тканевой инженерии клапана сердца на основе децеллюляризированного легочного аллографта, засеянного аутологичными эндотелиальными клет­ками, изолированными из вены предплечья за 4 нед до имплантации [48]. Данный клапан был имплантирован в позицию легочной артерии при проведении операции Росса. В послеоперационном периоде была отмечена регургитация легкой степени с нормальной функцией клапана, которая не прогрессировала в течение года.

С 2004 г. на Европейском рынке доступны клапаны, полученные методом тканевой инженерии и основан­ные на ксеногенных децеллюляризированных матрицах под торговыми названиями Matrix P и Matrix P Plus (Auto Tissue GmbH, Berlin, Germany), которые имплан­тированы уже более 1000 пациентам. Данные клапаны используются для протезирования легочного клапа­на при врожденных и приобретенных пороках сердца, а также при выполнении операции Росса. Однако эти виды клапанов все же не идеальны. A. Rueffer и соавт. сообщили в своей работе о развитии недостаточнос­ти легочного клапана после реконструкции выводного тракта правого желудочка у детей данными клапанами, из них 38% подверглись операции повторного протези­рования на ранних стадиях [49].

Хирургами нашей клиники (А. Haverich, А. Ciubotaru) в 2002 г. были проведены первые операции в детской клинике по имплантации тканево-инженерных кла­панов, полученных на основе аутологичных клеток. Мононуклеарные клетки были изолированы из перифе­рической крови детей и засеяны на децеллюляризированный аллогенный легочный клапан. После 21-го дня культивирования в биореакторе данные клапаны были имплантированы для реконструкции выводного тракта правого желудочка. Использование нами в целях ткане­вой инженерии аутологичных клеток не сопровождалось развитием иммунных реакций и признаков инфекции клапанов в послеоперационном периоде. Более того, наблюдение в динамике этих больных (более 7,5 лет) поз­волило констатировать не только нормальную функцию этих клапанов, но и признаки роста, подтвердив потен­циал к ремоделированию и росту клапанов в зависимости от соматического развития ребенка [50] (рис. 5).

Рисунок 5. 2D-эхокардиограмма, выполненная через 3 мес (А) и 3,5 года (В) после имплантации легочного клапана. Регургитация клапана (допплеровский режим) через 3 мес (С) и 3,5 года (D) после операции (по [35]).

С 2005 г. нами выполняются операции с использовани­ем децеллюляризированных кондуитов без аутологичных клеток. В настоящий момент проведены имплантации легочного кондуита более 40 пациентам. Возраст пациен­тов составлял от 2 мес до 21 года. Показаниями к опера­ции являлись тетрада Фалло, стеноз легочного клапана, недостаточность легочного клапана, атрезия легочного клапана, транспозиция магистральных артерий с легоч­ным стенозом, операция Росса. В настоящее время мы не имеем случаев повторных операций по поводу несосто­ятельности данных кондуитов. Данные эхокардиографии и магнитно-резонансной томографии сердца, выполняе­мых в динамике, показывают отсутствие дилатации или стеноза, кальцификации и дегенерации легочного кла­пана. Регургитация клапана соответствует степени 0—1 во всех случаях, трансвальвулярный градиент и конечный диастолический диаметр правого желудочка остаются стабильными.

В последнее время появляется все больше работ по изу­чению возможности имплантации аортального клапана, полученного методом тканевой инженерии. H. Baraki и соавт. опубликовано преклиническое исследование по имплантации децеллюляризированного аллографта аортального клапана в ортотопическую позицию на овцах [51]. Децеллюляризированная клапанная матрица была подвержена ре-целлюляризации эндотелиальными и интерстициальными клетками в условиях системного давления in vivo, сохранив возможность восстановления и роста клапана. Период наблюдения составил более 9 мес, при этом констатировано отсутствие структурной дилатации, аневризматического изменения и дегенера­ции данного аллографта. В качестве контрольной группы использовали нативные аллографты, показавшие каль­цификацию и дегенерацию створок клапанов через 3 мес после операции.

Одновременно с наметившимся бумом транскатетерных имплантаций клапанных стентов G. Lutter и соавт. впервые использовали комбинацию чрескожной имплантации стента в легочную позицию и кла­пана, полученного с помощью тканевой инженерии, в операциях на овцах [52]. При производстве стента был использован децеллюляризированный свиной ксенографт с засеянными аутологичными клетками. Для контроля позиционирования стентов во время имп­лантации, а также их функций проводилась ангио­графия, результаты которой отражали превосходные результаты. Через 4 нед после имплантации наличие эндотелиальных клеток было подтверждено методом иммуноцитохимии. Все это открывает новые перспек­тивы для дальнейшей реализации принципов тканевой инженерии в клинической практике.

Заключение

Несмотря на положительные клинические результа­ты имплантаций тканево-инженерных клапанов, многие технические проблемы и вопросы еще не разрешены.

Прогресс в разработке таких клапанов будет зависеть от успехов в области клапанной цитологии, эмбриональ­ного развития клапанов, изучения вопросов экспрессии гена, исследования стволовых клеток, а также дальней­шего изучения биомеханики клапанов.

Одновременно с достижением стандартизации произ­водства данных клапанов должны быть найдены опти­мальные пути их сохранения и транспортировки от про­изводителя непосредственно в операционный зал. Так, К. Narine и соавт. показали, что криоконсервация тканево-инженерных тканей, при которой низкие температуры оказывают деструктивное влияние на структурные свойс­тва ткани, не является оптимальным способом их хране­ния [53].

В то же время использование клапанов, полученных методами тканевой инженерии, и внедрение их в повсед­невную клиническую практику обусловливает необходи­мость дополнительных рандомизированных и многоцен­тровых клинических исследований.