ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время среди патологий кишечника наиболее часто встречаются заболевания с аутоиммунным типом воспаления, к которым относится язвенный колит (ЯК). Этиология ЯК остается неизвестной, определены только ведущие факторы, способствующие поддержанию хронического воспаления и аутоагрессии [1]. Данная патология встречается среди пациентов молодого и среднего возрастов (около 40 тыс. человек на территории России), при этом ежегодный прирост частоты ее встречаемости составляет более 11%, в связи с чем актуальной проблемой остается поиск новых маркеров в диагностике ЯК [2].
В результатах современных исследований отмечается важная роль воздействия кишечной микробиоты в развитии воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК). Прогрессирующим фактором воспаления при ЯК может быть дисбаланс между представителями различных кластеров бактерий. Уменьшение микробного биоразнообразия с последующим нарушением метаболизма бактерий способствует развитию этой патологии [3–6]. Есть сведения об участии представителей кишечной микробиоты в гомеостазе глюкозы с последующим нарушением процессов всасывания и снижения чувствительности тканей к инсулину, формированием инсулинорезистентности и сахарного диабета 2-го типа (СД 2). Это обусловлено развитием метаболического дисбиоза у лиц с ВЗК вследствие дисбиоза кишечных групп бактерий [7, 8].
Известно, что у пациентов с ЯК доминирующими типами кишечной микробиоты являются Firmicutes, Bacteroidota. Родовидовые представители этих мироорганизмов могут быть вовлечены в развитие воспалительного процесса и выступать новым биомаркером заболевания. Определение численности представителей кишечной микробиоты, оценка родовидового биоразнообразия может служить вспомогательным диагностическим критерием, способствующим своевременной верификации диагноза для пациентов с ЯК на фоне СД 2, а также другой коморбидной патологии [9, 10].
Цель исследования – оценить биоразнообразие кишечной микробиоты у пациентов с ЯК на фоне СД 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Проведено 16S рРНК секвенирование микробиома кишечника у 80 пациентов с ЯК и СД 2, 20 пациентов с ЯК и 20 соматически здоровых пациентов. Средний возраст обследуемых составил 50,1 ± 8,3 года.
Участникам выполнялось исследование лабораторных показателей: общий анализ крови (ОАК), оценка С-реактивного белка (СРБ), фекального кальпротектина (исследовался только при первичном обращении пациентов), глюкозы, липидного спектра (общего холестерина, липопротеидов низкой плотности), гликированного гемоглобина (HbA1c). Забор биоматериалов осуществлялся в период клинической ремиссии симптомов ЯК (поддерживающая терапия была идентичной во всех исследуемых группах – прием препаратов группы 5-аминосалициловой кислоты) в рамках динамического наблюдения на амбулаторном этапе.
В плане коррекции симптомов СД 2 сахароснижающая терапия у исследуемых была одинаковой – использование пероральных сахароснижающих средств из группы бигуанидов. Тотальную ДНК выделяли из образцов кала и сыворотки, подвергнутых гомогенизации в лизирующем растворе. Гомогенизация проводилась вместе с шариками, с последующей экстракцией ДНК методом сорбентной колонки. Биоинформатическая обработка полученных результатов выполнялась с применением биоинформатического пайплана, реализованного на языках программирования R v.3.6 и Python3 [11]. На первом этапе обработки последовательности праймеров обрезались для парных прочтений. Прочтения, не содержащие последовательности праймеров, удалялись. Затем производилось удаление прочтений с плохим качеством (балл Phred не менее 10) и коротких прочтений (не менее 200 пар нуклеотидов) [12]. После определения вариантов последовательностей прочтения конкатенировали, а полученные последовательности использовали для таксономической классификации (метод Naive Bayes) с применением референсной базы данных SILVA v138 [13, 14]. Идентификация родов бактерий осуществлялась посредством алгоритма точного совпадения в DADA2 по предварительно обработанным соответствующим образом последовательностям SILVA v138 с помощью пользовательских скриптов.
Оценка метаболического потенциала микробного сообщества у исследуемых групп пациентов в рамках данного исследования не проводилась.
Для расчета индекса разнообразия кишечной микробиоты (индекс Шеннона) на вход пакета vegan языка программирования R была подана матрица, содержащая общее количество вариантов последовательности ампликонов (ASV) на родовом уровне. Для парного сравнения индексов биоразнообразия использовался U-тест Манна – Уитни. С целью выявления особых таксонов применительно к каждой группе выполнялся частичный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов (sPLS-DA) при помощи программы multiomix (пакет программ mixOmics) на языке программирования R для установления параметров, максимально увеличивающих различия между сравниваемыми группами [15]. Визуализацию данных осуществляли с использованием пакета ggplot2 в среде R [16].
Статистическая обработка данных проводилась с применением программного обеспечения Statistica 12.6. Сравнение между представителями родового состава кишечной микробиоты осуществлялось посредством теста Вилкоксона с поправкой Хольма – Бонферонни. Различия между исследуемыми группами считали достоверно значимыми при p < 0,05. Количественные данные лабораторных исследований описывались с помощью медианы (Me), значений нижнего и верхнего квартилей (Q1–Q3). Сравнение двух групп по количественному признаку, распределение которого отличалось от нормального, проводилось с использованием U-критерия Манна – Уитни. Различия в значении показателя между признаками считались значимыми при p < 0,05. Исследование было выполнено на базе генетической лаборатории «Сербалаб».
РЕЗУЛЬТАТЫ
При оценке структуры пациентов с ЯК на фоне СД 2 по степени тяжести заболевания (в соответствии с индексом активности Мейо) у 55% участников была выявлена легкая (частота диарейного синдрома менее 5 р./сут.), у 32,5% – средняя степень (6–9 р./ сут.), у 12,5% – тяжелая степень (≥ 10 р./ сут.) ЯК. Определение эндоскопической активности при ЯК проводилось с использованием индекса Schroeder. У большинства исследуемых респондентов (у 85% пациентов с ЯК и СД 2 и у 75% больных с ЯК без метаболических нарушений) наблюдалась минимальная степень эндоскопической активности заболевания (рис. 1). Данные о степени тяжести, эндоскопической активности представлены по результатам оценки последней диагностированной атаки ЯК. При анализе протяженности поражения кишечника было установлено, что у пациентов с сочетанием ЯК и СД 2 в 55% случаев имел место проктит, в 35% – левосторонний колит, в 10% – тотальный колит. В свою очередь, у 65% пациентов с ЯК без СД 2 отмечался проктит, у 35% – тотальный колит (рис. 2).
Изучение медикаментозной терапии показало, что у 55% пациентов в лечении преобладала 1-я линия назначений (пероральный месалазин в дозе до 4 г/сут., а также его ректальные формы до 4 г/сут.), у 35% – 2-я линия (пероральный месалазин в дозе до 4 г/сут., ректальные формы месалазина до 4 г/сут., будесонид 1 мг/кг/сут. в ректальной форме, азатиоприн 1 мг/кг/сут.), у 10% – 3-я линия (препараты 2-й линии с добавлением инфликсимаба 5 мг/кг/сут.).
Исследованные лабораторные показатели в период клинической ремиссии симптомов ЯК (результаты ОАК, биохимического анализа крови, исследования фекального кальпротектина) у представителей групп отражены в таблице 1 (достоверно значимыми межгрупповые различия считались при p < 0,05). У пациентов с ЯК на фоне СД 2 наблюдалось достоверно значимое увеличение маркеров воспаления, а также показателей углеводного и липидного обменов по сравнению с группой больных без СД 2 (p = 0,043). У 28% пациентов не были достигнуты целевые показатели гликемического профиля, несмотря на регулярный прием сахароснижающих препаратов.
При иерархической кластеризации в исследованных образцах микробиома у соматически здоровых пациентов наиболее часто встречающимися были типы бактерий, к компонентам которых относилось более 50% детектированных прочтений: Firmicutes (43 ± 4,5%), Bacteroidota (22 ± 3,0%), Actinobacteroidota (9,5 ± 2,3%), Fusobacteriota (11,6 ± 2,6%), Proteobacteria (8,1 ± 1,4%), Verrucomicrobiota (2 ± 0,3%). Среди них были выявлены образцы с доминирующими родами бактерий Bacteroides (9,1–28,4%), Faecalibacterium (4,7–26%), Roseburia (2,3–7%), Prevotella (4,8–17,6%), Akkermansia (1,7–18,4%), Phascolactobacterium (1,6–3,4%), Streptococcus (0,6–8,4%).
У пациентов с ЯК преобладающими типами микроорганизмов являлись Firmicutes (64,7 ± 5,3%), Bacteroidota (19 ± 2,5%), Actinobacteroidota (14,7 ± 3,3%) и Proteobacteria (10,9 ± 1,2%). Среди родов бактерий доминировали Bifidobacteruim (1,4–31,5%), Faecalibacterium (3,2–14,3%), Anaerostipes (2,1–8,2%), Escherichia (0,7–12,8%), Clostridium (0,1–5,4%), Desulfovibrio (1,6–5,1%), Methanobrevibacter (0,01–6,2%).
В группе пациентов с ЯК и СД 2 преобладающими типами бактерий были Firmicutes (72,5 ± 4,8%), Bacteroidota (10,7 ± 3,5%), Actinobacteroidota (9,8 ± 2,1%), Proteobacteria (7,8 ± 0,2%), Verrucomicrobiota (5,4 ± 0,9), доминирующими родами – Bifidobacteruim (0,8–19,5%), Faecalibacterium (2,1–11,6%), Anaerostipes (1,1–6,4%), Escherichia (0,9–28,4%), Clostridium (0,6–6,8%), Akkermansia (0,4–9,1%), Methanobrevibacter (0,01–4,1%), Dorea (0,5–11,4%), Collinsella (0,9–2,8%) (рис. 3, 4).
При анализе индекса Шеннона в исследуемых группах в результате попарного сравнения у соматически здоровых пациентов и пациентов с ЯК статистически значимых различий выявлено не было (p = 0,0445), медиана (Me) индекса равнялась 2,25 ± 0,15 бит/экз. У соматически здоровых пациентов величина этого показателя составила 2,64 ± 0,2 бит/экз., у пациентов с ЯК – 2,66 ± 0,12 бит/экз. При оценке индекса биоразнообразия между больными с ЯК и ЯК в сочетании с СД 2 также не было статистически значимых различий (p = 0,0119), медиана (Me) была равна 2,1. Значения данного параметра в этих группах составили 2,66 ± 0,12 и 2,58 ± 0,16 бит/ экз. соответственно. Отсутствие значимых различий в показателях индекса биоразнообразия может быть ассоциировано с преобладанием численности условно-патогенных, патогенных и других штаммов, принимающих участие в воспалении слизистой оболочки кишечника, у пациентов как с изолированным ЯК, так и при сочетании этого заболевания с СД 2. В ряде проведенных исследований было выявлено увеличение численности, активности условно-патогенной флоры в результате дисбиоза [17], а также изменение микробного потенциала, участвующего в развитии метаболических нарушений, что влечет за собой повышенный потенциал синтеза аминокислот [18].
По данным оценки биоразнообразия кишечной микробиоты, у пациентов с ЯК доминирующими типами бактерий являлись Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Euryarchaeota. Среди представителей Actinobacteriota обращало на себя внимание увеличение у пациентов с ЯК численности микроорганизмов рода Bifidobacterium, среди Firmicutes – родов Dorea (при ЯК и СД 2), Clostridium, Enterococcus, Streptococcus, со снижением содержания основных бутират-производителей (Roseburia, Faecalibacterium). Внутри типа Pseudomonadota отмечалось повышение количества бактерий рода Escherichia, внутри Euryarchaeota – Methanobrevibacter.
В ряде исследований сообщается о снижении представителей типов Firmicutes, Bacteroidota у лиц с ВЗК [19], однако в нашем исследовании мы не обнаружили эту тенденцию. Аналогичные результаты были получены и при изучении роли дисбиоза в развитии ЯК и болезни Крона, где также обнаружено доминирование типов Firmicutes, Bacteroidota [20].
Нами было выявлено увеличение численности бактерий рода Bifidobacteium среди пациентов с ЯК, ЯК и СД 2, а также отсутствие или крайне низкое содержание Lactobacterium во всех трех группах исследуемых респондентов (табл. 2).
При оценке численности условно-патогенных и патогенных бактерий было обнаружено значительное увеличение их представителей (табл. 3) у пациентов с ЯК, с ЯК и СД 2. Выявленное снижение количества некоторых бутират-производителей (Faecalibacterium и Roseburia – в пределах референсных значений во всех исследуемых группах, Anaerostipes – ниже референсных показателей у пациентов с ЯК; табл. 4), наряду с увеличением численности метан-продуцентов (Methanobrevibacter, Methanosphaera) у пациентов с ЯК (табл. 5), может говорить о наличии воспаления в слизистой оболочке кишечника. Нами установлена положительная статистически значимая корреляционная связь между численностью Methanobrevibacter и уровнем лейкоцитов, скоростью оседания эритроцитов (p = 0,029, р = 0,034 соответственно). Также была обнаружена значимая корреляционная связь между уровнем скорости оседания эритроцитов (СОЭ), С-реактивного белка и численностью Escherichia (p = 0,0432, p = 0,0487 соответственно), количеством Anaerostipes и СОЭ, уровнем лейкоцитов (p = 0,031, p = 0,031). Результаты количественной оценки бактерий, участвующих в углеводном обмене (Akkermansia, Dorea, Collinsella, Lachnospira), приведены в таблице 6. Найдена статистически значимая связь между уровнями Dorea и Akkermansia и содержанием глюкозы в крови (р = 0,05, p = 0,03 соответственно), а также между численностью Lachnospira и показателями гликированного гемоглобина (p = 0,002; табл. 7).
ОБСУЖДЕНИЕ
Достаточное количество в микробиоме основных бутират-производителей (Faecalibacterium, Roseburia, Anaerostipes) ассоциировано со здоровьем кишечника и его защищенностью от воспалительных процессов и метаболических нарушений. Это связано с расщеплением микроорганизмами пектина и других источников углерода, таких как d-глюкозамин и N-ацетил-d-глюкозамин. Снижение численности данных бактерий у пациентов с ЯК и СД 2 может свидетельствовать о развитии дисбиоза, что, в свою очередь, может способствовать прогрессированию воспалительного процесса. Известно об ассоциации между ЯК и нарушением баланса флоры, с увеличением численности Firmicutes, Bacteroidota [21]. Это может быть обусловлено нарушением гомеостатического баланса, приводящим к росту численности патогенной флоры и увеличению степени разнообразия патоген-ассоциированных молекулярных паттернов. При нарушении баланса между кластерами некоторые кишечные бактерии не способны производить необходимые для оптимального функционирования метаболиты, что влечет усиление симптомов основного заболевания [22].
У пациентов с ЯК увеличено количество бактерий рода Bifidobacterium, образующего лактат и ацетат, которые используют другие бактерии для производства бутирата. Эти бактерии обладают иммуномодулирующими, защитными и противовоспалительными свойствами. Несмотря на полезные свойства бактерий рода Bifidobacterium, высокие уровни некоторых его видов могут быть неблагоприятны для слизистого барьера кишечника, так как они колонизируют слой слизи кишечника. Некоторые виды содержат множество ферментов гликозилгидролаз, которые способны в значительной степени разрушать гликаны муцина и нарушать слизистый барьер кишечника, увеличивая проницаемость для патогенных и условно-патогенных бактерий.
Возрастание численности метан-продуцентов (Methanobrevibacter) может быть связано с превращением газообразного водорода в метан. Удаление водорода повышает эффективность микробной ферментации углеводных субстратов в экосистеме кишечника человека. Избыточная продукция метана Methanobrevibacter может влиять на развитие симптомов при ЯК (метеоризма, болевого синдрома) за счет образования газообразного водорода и поддержания хронического воспаления [23]. Также в некоторых исследованиях подтверждена ассоциация между приемом месалазина – одного из основных препаратов в лечении пациентов с ЯК – и высокой концентрацией Methanobrevibacter. Это обусловлено изменением течения заболевания у пациентов с ВЗК за счет нормализации окислительно-восстановительного потенциала, увеличения облигатных анаэробов в кишечнике. В последние годы показано, что изменение численности метан-продуцирующих архей может оказывать влияние на течение ВЗК. В ряде работ выявлена обратная корреляционная связь между бактериальной нагрузкой и восприимчивостью к ЯК [24, 25].
Влияние на углеводный обмен бактерий рода Akkermansia, Dorea, Collinsella может быть объяснено действием их активных метаболитов. Известно, что увеличенное количество представителей рода Collinsella ассоциируется с развитием СД 2, атеросклеротического поражения сосудов, дислипидемии (повышенное содержание данной бактерии сопряжено с повышенным уровнем триглицеридов, а также липопротеидов низкой плотности). Метаболиты и бактериальные компоненты микробиоты кишечника влияют на инициацию и прогрессирование СД 2. В некоторых исследованиях обнаружено увеличение количества бактерий, разрушающих муцин (Akkermansia), а также повышение уровня Dorea, что указывает на аномальные изменения в микробиоте кишечника как в период нарушения толерантности к глюкозе, так и на фоне СД 2 [26, 27]. При этом в некоторых исследованиях отмечена роль увеличения численности Akkermansia в модуляции микробиоты кишечника, что способствует уменьшению воспаления кишечника при приеме сахароснижающих средств (метформина) [6].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Доминирующими типами бактерий во всех исследуемых группах пациентов были Actinobacteriota, Firmicutes и Bacteroidota. У пациентов с ЯК наблюдалось снижение численности некоторых бутират-продуцирующих групп бактерий (Anaerostipes), а также увеличение метан-продуцирующих (Methanobrevibacter). У лиц с диагностированным СД 2 оказалось повышенным содержание представителей микробиоты кишечника, влияющих на углеводный обмен (Dorea, Collinsella).
Изменение численной структуры родового состава бактерий, участвующих в углеводном обмене, может быть одним из факторов риска развития СД 2 у пациентов с ЯК. Полученные данные могут указывать на диагностическое значение оценки изменений кишечной микробиоты как одной из ведущих предпосылок в развитии указанной коморбидности и послужить основой для усовершенствования лечебных мероприятий у соответствующих пациентов. Требуется дальнейшее изучение роли кишечной микробиоты в патогенезе хронических неинфекционных заболеваний, включая ВЗК.
