Восстановление кровотока в инфарктсвязанной коронарной артерии с помощью тромболизиса или стентирования — наиболее эффективный метод лечения инфаркта миокарда (ИМ). Однако при реперфузии концентрация кислорода (О2) в миокарде резко возрастает, и растворенный в липидном матриксе кардиомиоцитов О2 немедленно восстанавливается переносчиками дыхательной цепи,
при этом возникают благоприятные условия для образования О2 – и его дериватов [1]. Это происходит на фоне ограничения способности клеток миокарда инактивировать возникающие активированные кислородные метаболиты (АКМ), что обусловлено снижением активности антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы) во время предшествующий ишемии миокарда [1].
В связи с этим одной из наиболее действенных мер для ослабления патологических последствий ишемии и реперфузии является введение препаратов, обладающих антиоксидантными свойствами и способных ингибировать либо сами АКМ, либо источник их генерации [2]. При этом исходя из того, что основной «взрыв» образования АКМ приходится на первые минуты реперфузии, наибольшим эффектом обладает антиоксидантная терапия, проведенная либо в ишемический, либо в ранний реперфузионный период [3].
n-Тирозол — водорастворимый синтетический аналог действующего начала родиолы розовой [4], обладающий антиоксидантными и гемореологическими свойствами [5, 6].
Целью настоящей работы явилось исследование антиоксидантной и кардиопротекторной активности n-тирозола при ишемии миокарда с реперфузией у крыс.
Материал и методы
Исследование проведено на 51 крысе-самце Вистар массой 200—250 г. Для моделирования ишемии миокарда у наркотизированных метогекситалом натрия (100 мг/кг внутрибрюшинно) крыс (n=31) после интубирования и подключения к аппарату искусственной вентиляции легких АИД-2 накладывали лигатуру на левую коронарную артерию по методу А.Х. Когана [7] без нарушения топографии сердца в грудной клетке. Через 45 мин лигатуру развязывали, ушивали рану, помещая концы лигатуры под кожу. Животных переводили на самостоятельное дыхание. Животным опытной группы вводили
внутривенно n-тирозол в дозе 20 мг/кг, животным контрольной группы — эквиобъемное количество физиологического раствора на 10-й минуте ишемии, через 4 и 22 ч после начала реперфузии (с учетом фармакокинетических показателей препарата [8]).
Через сутки после реперфузии крыс вновь наркотизировали, подключали к аппарату искусственной вентиляции легких и затягивали лигатуру. Для выявления зоны гипоперфузии внутривенно болюсом вводили 0,2 мл 5% раствора красителя patent blue violet (Sigma) и через 10—20 с извлекали сердце. При этом участки миокарда с сохраненной перфузией окрашивались в зеленый цвет, а неперфузируемые оставались неокрашенными. Поперечные срезы левого желудочка толщиной
300 мкм числом 39—42 (в зависимости от размера сердца) приготавливали на замораживающем микротоме.
Полученные срезы распределяли по 3 предметным стеклам, размещая на каждое по одному из трех смежных срезов. Срезы на одном стекле оставляли в нативном виде (для оценки зоны гипоперфузии), срезы на двух других стеклах окрашивали нитросиним тетразолием (Sigma) по Зелигману и Рутенбергу [9] для выявления в ткани дегидрогеназной активности. Срезы заключали в глицериново-желатиновый гель и сканировали. Оценку размера зон гипоперфузии и изменения дегидрогеназной активности проводили с использованием программы Adobe Photoshop CS2.
За зону инфаркта принимали зоны с резким снижением дегидрогеназной активности. Для этого на срезах миокарда выделяли участки, суммарная интенсивность окраски которых была снижена в 2,5 раза и более относительно интактных областей миокарда, что отражает топографию снижения в той же степени дегидрогеназной активности [10].
На протяжении всего периода ишемии и реперфузии миокарда, а также через сутки у крыс проводили мониторирование электрокардиограммы (ЭКГ). Ее регистрировали во II стандартном отведении на приборе EEG 8S (Венгрия).
Антиоксидантную активность п-тирозола исследовали в отдельной серии экспериментов на 20 наркотизированных этаминал-натрием (60 мг/кг) крысах на этой же модели острой ишемии миокарда с реперфузией. На 15-й минуте рециркуляции животных декапитировали, извлекали сердце, выделяли левый желудочек, который отмывали от сгустков крови, добавляли ЭДТА из расчета 1 мг/г ткани и гомогенизировали.
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) — диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК), оснований Шиффа (ОШ) определяли в липидных экстрактах, полученных
из гомогената тканей миокарда по методу, описанному в работе А.Б. Косухина и соавт. [11]. ДК и ТК
определяли на спектрофотометре Hitachi модель 557 (Япония) [12]. Индекс окисления липидов оценивали по соотношению показателей оптической плотности ДК и неокисленных липидов [13]. ОШ определяли флюоресцентным методом [14] на спектрофлюориметре Hitachi модель 850 (Япония). Содержание ДК, ТК и ОШ рассчитывали в относительных единицах на 1 мг липидов. Количественную оценку содержания липидов проводили гравиметрически.
Статистическую обработку данных выполняли стандартными методами с применением t-критерия Стьюдента и критерия χ2 с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0. Результаты считали значимыми при р<0,05.
Результаты
Использованная модель ИМ характеризуется сохранением в сердце во время ишемии редуцированного кровообращения, и, следовательно, притока субстратов и кислорода, что способствует активации процессов ПОЛ; вместе с тем сохранение венозного оттока снижает степень ацидоза и уменьшает аккумуляцию продуктов ПОЛ в органе [13]. Особенностью этой модели является также усиление процессов ПОЛ в миокарде вследствие выброса катехоламинов [15].
Через 15 мин реперфузии в миокарде крыс контрольной группы наблюдалась активация процессов ПОЛ. При этом содержание первичных (ДК и ТК) и вторичных (ОШ) продуктов ПОЛ увеличивалось по сравнению с таковым в группе интактных животных на 47, 54 и 86% соответственно (табл. 1). При анализе индекса окисленности липидов было установлено, что по сравнению с группой интактных крыс у контрольных животных он достоверно увеличивался на 27%. Таким образом, в условиях ишемии
и последующей реперфузии в миокарде крыс происходила выраженная активация процессов ПОЛ.
Введение п-тирозола на 15-й минуте периода ишемии ограничивало липопероксидацию. Содержание ДК и ТК было ниже, чем в контроле, на 16 и 20% соответственно. При этом повышение индекса окисления липидов в группе крыс, получавших п-тирозол, относительно значений контрольных животных не достигало уровня статистической значимости (см. табл. 1).
Таблица 1. Влияние n тирозола на содержание диеновых конъюгатов, триеновых конъюгатов, оснований Шиффа и индекса окисленности.
Таблица 2. Влияние n тирозола на параметры ЭКГ крыс через 1 сут после ишемии реперфузии миокарда.
В контрольной группе животных в первые 2—3 ч реперфузии левого желудочка погибли 7 (39%) крыс из 18. В группе п-тирозола смертность достоверно снижалась: погибло лишь одно (8%) животное из 13.
Через 1 сут после возобновления перфузии миокарда на ЭКГ крыс обеих групп наблюдалось появление патологического зубца Q, свидетельствующего о наличии некротических изменений в миокарде, и снижение амплитуды зубца T относительно исходных значений. Снижение вольтажа зубца T в контрольной группе было весьма значительным, у 5 животных из 11 на ЭКГ отмечено появление отрицательного зубца T (табл. 2). Отрицательный зубец T на ЭКГ в подострой стадии ИМ характеризует наличие зоны ишемизированных кардиомиоцитов, окружающих область некроза [16]. Через 1 сут после восстановления кровоснабжения миокарда в контрольной группе сохранялось существенное снижение амплитуды зубца R относительно исходных значений (см. табл. 2), характеризующее нарушение процесса деполяризации желудочков вследствие выключения части миокарда из процессов возбуждения [16].
В группе животных п-тирозола через 1 сут после реперфузии миокарда снижение амплитуды зубца T было менее выраженным, чем в контрольной группе. Если частота формирования зубца Q на ЭКГ через 1 сут после эпизода ишемии-реперфузии в контрольной и опытной группах была одинаковой, то частота выявления отрицательного зубца T в группе п-тирозола (1 из 12) была достоверно ниже, чем в контрольной. В группе крыс, которым вводили n-тирозол, выявлялась отчетливая тенденция (р<0,1)
к нормализации амплитуды зубца R относительно контрольной группы, поэтому снижение этого показателя относительно исходных значений через 1 сут было недостоверным (см. табл. 2).
Определение размеров зон гипоперфузии в контрольной группе и группе с введением n-тирозола позволило выявить, что эти зоны совпадали по величине и составляли соответственно 32,1±2,2 и 31,9±2,3% от общей площади поперечных срезов миокарда.
В контрольной группе зона резко сниженной дегидрогеназной активности составила в среднем 23,0±2,0% от общей площади срезов миокарда и занимала 72,7±5,1% от площади зоны гипоперфузии. У крыс опытной группы зона резко сниженной дегидрогеназной активности составила 16,7±1,8% от общей площади миокарда и 53,7±6,3% от площади зоны гипоперфузии и была на 19% меньше
(p<0,05), чем в контрольной группе.
Таким образом, внутривенное введение n-тирозола в ишемическом периоде ограничивало выраженность окислительного стресса в ткани миокарда в ранний постреперфузионный период и способствовало более высокой сохранности миокардиоцитов и уменьшению зоны ИМ, что, вероятно, приводило к существенному снижению частоты гибели животных.
Работа поддержана грантом РФФИ №06—1116/04.
