Успешность профилактики сосудистых осложнений во многом зависит от эффективности антитромбоцитарной терапии, в том числе у больных после коронарного шунтирования. В последние 10—15 лет появилось большое количество работ, свидетельствующих о наличии у ряда больных недостаточного ответа агрегации тромбоцитов на ацетилсалициловую кислоту [1—5]. Тиенопиридины также не всегда успешно предотвращают сердечно-сосудистые осложнения (ССО). При наличии слабо функционального аллеля CYP2C19 у пациентов с острым инфарктом миокарда, получавших клопидогрел, отмечена более высокая частота развития ССО, в 3,58 раза превышающая таковую у других пациентов. Особенно это было заметно среди пациентов, перенесших чрескожные коронарные вмешательства (ЧКВ) [6]. G. Parodi и соавт. показали, что тикагрелор и прасугрел недостаточно ингибируют агрегацию тромбоцитов у больных с острым коронарным синдромом (ОКС). Через 2 ч после ЧКВ у 44% пациентов, получивших прасугрел, и у 60%, получивших тикагрелор, отмечена высокая остаточная реактивность тромбоцитов [7]. Становится очевидным, что у некоторых больных, в силу целого ряда в основном неизвестных причин, тромбоциты недостаточно отвечают на антитромбоцитарные препараты, независимо от их механизма действия. Результаты приведенных исследований побуждают к более детальному изучению влияния метаболических изменений на рецепторную (агрегационную) активность тромбоцитов при ишемической болезни сердца (ИБС).
Тромбоцитам в системе гемостаза отводится ключевая роль. При этом функциональная активность тромбоцитов во многом определяется состоянием их метаболической системы. Именно от активности внутриклеточного метаболизма зависит синтез поверхностных рецепторов, биологически активных веществ, которые выделяются тромбоцитами, состояние мембран тромбоцитов, что напрямую определяет реактивность системы гемостаза в целом, в том числе патофизиологических процессов [8—11]. Известно, что у больных стабильной стенокардией отмечаются значительные изменения метаболического статуса тромбоцитов [12].
Цель: изучить особенности уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах у больных ИБС после аортокоронарного шунтирования (АКШ) в зависимости от их чувствительности к клопидогрелу.
Материал и методы
Под нашим наблюдением находился 51 больной мужского пола в возрасте от 45 до 72 лет с хронической формой ИБС. В качестве контроля обследованы 35 здоровых мужчин сопоставимого возраста. У всех больных было выполнено АКШ. Изучение спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов под действием 5 мкМ АДФ проводили на агрегометре «Биола» до операции (двухнедельная отмена антитромбоцитарных препаратов), после АКШ на фоне терапии 75 мг клопидогрела и через 6 мес после операции. В зависимости от подавления зависимой от АДФ агрегации тромбоцитов на 50% от исходной или отсутствия таковой все пациенты были разделены на 2 группы: чувствительные (n=41) и резистентные (n=10) к клопидогрелу.
Уровни активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах крови определяли с помощью биолюминесцентного метода [13]. Биолюминесцентный анализ проводили с использованием биферментного препарата, выделенного из Photobacterium leognathi (получен в Институте биофизики СО РАН, Красноярск), и биохемилюминесцентного анализатора БХЛ-3606М (специальное конструкторско-технологическое бюро «Наука», Красноярск). Данным методом определяли активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФ-МДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАД-ГДГ и НАДФ-ГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАД-ИЦДГ и НАДФ-ИЦДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Активность оксидоредуктаз выражали в ферментативных единицах (ед) на 1 мг белка (1 ед=1 мкмоль/мин [14]). Содержание белка определяли по методу Брэдфорда.
Описание выборки производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартального размаха в виде 25-го и 75-го процентилей. Проверку гипотезы о статистической достоверности величин исследуемых показателей проводили с помощью критерия Манна—Уитни. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0.
Результаты и обсуждение
При исследовании уровней активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ тромбоцитов обнаружено, что у чувствительных к клопидогрелу больных ИБС повышается активность НАДФ-МДГ (рис. 1, А) и снижаются уровни ГР (рис. 1, Б) и НАДФН-ГДГ (рис. 1, В). При этом активность НАДФ-МДГ в тромбоцитах остается повышенной через 2 нед и 6 мес после АКШ. Активность ГР и НАДФН-ГДГ также остается пониженной в этот же период после операции. Через 2 нед после АКШ у больных ИБС снижается активность НАДФ-ИЦДГ и остается пониженной через 6 мес после операции (рис. 1, Г).
У чувствительных к клопидогрелу больных ИБС до операции в тромбоцитах снижена активность Г3ФДГ (рис. 2, А), ЛДГ (рис. 2, Б), НАДН-ЛДГ (рис. 2, В) и НАДН-МДГ (рис. 2, Г). Уровни активности данных ферментов остаются пониженными как через 2 нед, так и через 6 мес после АКШ. В то же время пониженная до операции активность НАД-ГДГ через 2 нед после АКШ повышается до контрольной, но через 6 мес снова снижается до исходной (рис. 2, Д).
При исследовании активности НАДФ-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах у резистентных к клопидогрелу больных ИБС установлено, что активность Г6ФДГ (рис. 3, А), НАДФ-ИЦДГ (рис. 3, Б), ГР (рис. 3, В) и НАДФН-ГДГ (рис. 3, Г) снижены относительно контрольных значений в период до проведения АКШ. При этом активность Г6ФДГ повышается до контрольного диапазона через 2 нед после операции и остается повышенной через 6 мес. Активность ГР в тромбоцитах больных ИБС повышается через 6 мес после АКШ. В то же время уровни активности НАДФ-ИЦДГ и НАДФН-ГДГ остаются пониженными на всем диапазоне наблюдения. Активность НАДФ-ГДГ в тромбоцитах больных ИБС, исходно соответствующая контрольной, через 2 нед после АКШ снижается, а через 6 мес после операции повышается (рис. 3, Д). Активность НАДФ-МДГ в тромбоцитах у резистентных к клопидогрелу больных ИБС до операции и через 2 нед после АКШ соответствует контрольному уровню, через 6 мес значительно повышается (рис. 3, Е).
У резистентных к клопидогрелу больных ИБС до операции и на всем протяжении наблюдения после АКШ снижена активность Г3ФДГ (рис. 4, А), ЛДГ (рис. 4, Б), МДГ (рис. 4, В), НАД-ГДГ (рис. 4, Г), НАДН-ЛДГ (рис. 4, Д) и НАДН-МДГ (рис. 4, Е). Активность НАДН-ГДГ-3 8,01 (2,28; 24,51) мкед у больных данной категории до операции ниже (р=0,025), чем у лиц контрольной группы, — 84,71 (27,22; 150,55) мкед. Через 2 нед после АКШ активность НАДН-ГДГ также остается пониженной — 5,51 (2,02; 8,48) мкед, но повышается до контрольного диапазона через 6 мес — 61,23 (15,48; 132,22) мкед.
При сравнении уровней активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ тромбоцитов у чувствительных и резистентных к клопидогрелу больных ИБС обнаружено, что активность Г6ФДГ и НАДФ-ИЦДГ у чувствительных к клопидогрелу пациентов до операции выше, чем у резистентных (р=0,049 и р=0,029 соответственно). Через 2 нед и 6 мес после операции активность НАДФ-ИЦДГ в тромбоцитах у чувствительных к клопидогрелу больных остается выше, чем у резистентных (р=0,028 и р=0,037 соответственно). Через 6 мес после АКШ активность НАДФ-МДГ в тромбоцитах у чувствительных к клопидогрелу больных ИБС выше, чем у резистентных (р=0,046). В то же время активность НАДФ-ГДГ в этот же период у чувствительных к клопидогрелу больных значительно ниже, чем у резистентных (р=0,030). Активность МДГ в тромбоцитах у чувствительных к клопидогрелу больных ИБС значительно выше, чем у резистентных к клопидогрелу пациентов до операции (р=0,042), а также через 2 нед (р=0,037) и 6 мес после АКШ (р=0,007).
Исследуемые оксидоредуктазы занимают ключевые позиции основных метаболических путей. Анализ оксидоредуктаз позволяет не только оценить активность отдельных ферментов, но и определить интенсивность метаболических путей или циклов, а также реактивность метаболических процессов в целом [14]. Так, Г6ФДГ является ключевым ферментом пентозофосфатного цикла, от активности которого зависит ряд пластических процессов [15, 16]. Снижение активности данного фермента в тромбоцитах больных ИБС, резистентных к клопидогрелу, до операции определяет недостаточность синтетических процессов в клетках. Однако уже через 2 нед после операции активность фермента восстанавливается до контрольных значений. Необходимо отметить, что пентозофосфатный цикл также является основным конкурентом гликолиза за субстрат [14, 15]. При этом у больных ИБС независимо от чувствительности к клопидогрелу выявляется низкая активность анаэробной реакции ЛДГ, характеризующей интенсивность субстратного потока на уровне терминальных реакций гликолиза. Необходимо отметить, что активность аэробной реакции ЛДГ также снижена в тромбоцитах больных ИБС независимо от чувствительности к клопидогрелу. Ферментом, осуществляющим перенос продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза, является Г3ФДГ [17, 18], уровень активности которого понижен в тромбоцитах больных ИБС независимо от их чувствительности к клопидогрелу. Ферментом, характеризующим состояние липидного анаболизма, является НАДФ-МДГ [19, 20]. Установлено, что если у больных с чувствительностью к клопидогрелу активность НАДФ-МДГ выше контрольного уровня на всем протяжении исследования, то у резистентных к клопидогрелу пациентов активность фермента до АКШ и через 2 нед после него ниже контрольного диапазона, но через 6 мес повышается, тем не менее оставаясь ниже, чем в тромбоцитах у чувствительных к клопидогрелу больных ИБС.
Известно, что НАДФН, синтезируемый в реакциях пентозофосфатного цикла и липидного анаболизма, также используется в глутатионзависимой антиоксидантной системе для восстановления окисленного глутатиона [14, 21]. Однако у больных ИБС независимо от чувствительности к клопидогрелу активность ГР в тромбоцитах на всем протяжении исследования остается ниже контрольных значений. С помощью корреляционного анализа у лиц контрольной группы обнаружена положительная взаимосвязь активности ГР с уровнем НАДФ-МДГ (r=0,41; р=0,048), которая в слабой степени отражает большее влияние малик-фермента на восстановление окисленного глутатиона. У чувствительных к клопидогрелу больных ИБС до операции и через 6 мес после нее взаимосвязей между уровнями активности Г6ФДГ, НАДФ-МДГ и ГР в тромбоцитах не обнаружено, тогда как через 2 нед после АКШ выявляется отрицательная взаимосвязь между НАДФ-МДГ и ГР (r=–0,54; р=0,006). По-видимому, у больных данной категории нарушения метаболизма тромбоцитов проявляются в противоположном изменении процессов липидного анаболизма и активности глутатионзависимой антиоксидантной системы. У резистентных к клопидогрелу пациентов только до операции обнаружена положительная взаимосвязь между уровнями активности Г6ФДГ и НАДФ-МДГ (r=0,87; р=0,003), характеризующая высокую степень зависимости между реакциями пентозофосфатного цикла и липидного анаболизма. Взаимосвязей между данными ферментами у резистентных к клопидогрелу больных ИБС не обнаружено.
В тромбоцитах сохранились и функционируют митохондрии [22, 23], поэтому биоэнергетика данного типа клеток определяется не только анаэробным окислением глюкозы, но и аэробными процессами. Интенсивность аэробного дыхания во многом определяется активностью цикла трикарбоновых кислот [14]. При этом если у чувствительных к клопидогрелу пациентов активность МДГ и НАД-ИЦДГ (ферменты лимонного цикла) соответствует контрольным значениям, то активность МДГ в тромбоцитах резистентных к клопидогрелу пациентов значительно ниже контрольного диапазона и уровней, выявляемых у чувствительных к клопидогрелу больных. В то же время активность НАДН-МДГ в тромбоцитах больных ИБС снижена независимо от чувствительности к клопидогрелу. Кроме того, если активность НАДФ-ИЦДГ (вспомогательная реакция лимонного цикла) в тромбоцитах резистентных к клопидогрелу больных снижена на всем периоде исследования (относительно контрольного диапазона и уровня, выявляемого у чувствительных к клопидогрелу пациентов), то у чувствительных к клопидогрелу больных активность фермента снижается относительно контрольных значений через 2 нед и 6 мес после АКШ. Подобное состояние ферментов, определяющих интенсивность субстратного потока по циклу Кребса, отражает нормальный уровень аэробных процессов в тромбоцитах чувствительных к клопидогрелу больных ИБС и значительное снижение таковых до и после АКШ у резистентных пациентов.
Цикл трикарбоновых кислот, являясь амфиболическим, тесно взаимосвязан с реакциями аминокислотного обмена [14]. Связующими ферментами являются глутаматдегидрогеназы, которые также участвуют в реакциях азотного обмена. У чувствительных к клопидогрелу больных ИБС активность НАДФ- и НАДН-зависимых глутаматдегидрогеназ соответствует контрольному диапазону, тогда как активность НАДФН-ГДГ снижена, что соответствует пониженному уровню НАДФН-зависимого оттока субстратов с цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена. В то же время при резистентности к клопидогрелу наблюдается снижение активности и НАД(Н)- и НАДФ(Н)-зависимых глутаматдегидрогеназ, что определяет снижение интенсивности субстратного обмена между лимонным циклом и реакциями аминокислотного обмена.
Таким образом, метаболизм тромбоцитов больных ИБС независимо от чувствительности к клопидогрелу характеризуется снижением активности анаэробной энергетики, глутатионзависимой антиоксидантной системы, а также реакций, осуществляющих перенос продуктов липидного катаболизма на гликолиз и НАДФН-зависимый отток субстратов с лимонного цикла на аминокислотный обмен (рис. 5). Метаболическими механизмами тромбоцитов, характеризующими состояние резистентности к клопидогрелу, являются низкая активность ключевой реакции пентозофосфатного цикла, отражающей состояние пластического обмена и субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот, определяющего интенсивность аэробной энергетики. Только у чувствительных к клопидогрелу больных ИБС в тромбоцитах повышается активность НАДФ-МДГ (ключевой реакции липидного анаболизма). Не исключено, что отличия в метаболизме тромбоцитов у больных ИБС являются генетически детерминированными и могут быть одной из причин измененной реактивности тромбоцитов. Именно у больных этой категории с измененным метаболическим статусом не удается преодолеть на фоне терапии клопидогрелом высокую реактивность тромбоцитов. Установление метаболических особенностей тромбоцитов у больных с высокой остаточной реактивностью на клопидогреле позволяет продолжить поиск оптимальных лекарственных воздействий как на рецепторный аппарат клетки, так и на метаболизм тромбоцитов.
