Аритмия является либо самостоятельной формой заболевания сердца, либо осложнением других заболеваний [1, 2]. Ее причинами могут быть как органические нарушения в системе проведения возбуждения по миокарду, так и функциональные, связанные с чрезмерным возбуждением симпатической части вегетативной нервной системы, в частности, при так называемом социальном стрессе [3]. Эти нарушения связаны с повышением возбудимости центров автоматизма II и III порядка [4] вследствие вызываемого катехоламинами увеличения проводимости по медленным кальциевым каналам и усиленного освобождения Са2+ из саркоплазматической сети, причем кальциевые блокаторы успешно блокируют аритмию [5—8]. Катехоламины не только непосредственно влияют на белки кальциевого транспорта, но и провоцируют в клетках развитие окислительного стресса. Он возникает в кардиомиоцитах при усиленном потреблении кислорода или усилении разобщения окисления и фос- форилирования в митохондриях [9], а это закономерно происходит при действии адреналина в повышенных концентрациях. Образуемые митохондриями активные формы кислорода являются активными модуляторами кальциевого транспорта в кардиомиоцитах [10—13]. В частности, супероксид и пероксид водорода в повышенных концентрациях ингибируют натриевые и кальциевые насосы [14], блокируют кальмодулин, ингибируют рианодиновый рецептор и вызывают массивный выход Са2+ из саркоплазматической сети [14, 15], а оксид азота оказывает противоположное действие [13]. Поэтому ограничение образования активных форм кислорода потенциально способно уменьшить проаритмический эффект катехоламинов.
В последние годы исследователи уделяют значительное внимание естественному антиоксиданту электронно-транспортной цепи митохондрий — коэнзиму Q10 (убихинону). Он представляет единственный синтезируемый в организме мембранный антиоксидант, способный ограничивать повреждения миокарда при окислительном стрессе в случае алиментарного применения [16—18]. Однако существуют проблемы с его доставкой в митохондрии, поскольку он может встраиваться не только в митохондриальные, но и в другие мембраны. Это было преодолено с помощью проникающих в митохондрии ионов Скулачева [19, 20]. Присоединение к катиону трифенилфосфония коэнзима Q10 (MitoQ) действительно повысило антиоксидантную способность по отношению к супероксиду, пероксинитриту и перекисному окислению липидов [20] и повышало устойчивость сердца к постишеми- ческим повреждениям [21].
Недавно группой химиков под руководством В.П. Скулачева была синтезирована новая молекула, получившая обозначение SkQ1 [9], в которой, в отличие от MitoQ, убихинон заменен пластохиноном, выполняющим в растительных клетках аналогичную функцию, но являющимся более эффективным антиоксидантом, чем коэнзим Q10 [22]. Ранее было установлено, что предварительное назначение данного препарата значительно уменьшало частоту аритмии, вызванную пероксидом водорода или постишемической реперфузией сердца [23, 24]. Ограничение аритмии может быть связано с прекращением осцилляций цитоплазматического Са2+, наблюдавшимся в опытах на клетках поджелудочной железы после встраивания MitoQ в митохондриальные мембраны [25]. Выяснилось, что в основе этого эффекта лежит прекращение периодического выделения митохондриями активных форм кислорода, которые окисляют молекулы белков кальциевого транспорта.
В данной работе мы испытали молекулу SkQ1 в качестве вероятного протектора сердца на модели аритмии, вызванной адреналином. Она закономерно возникает у различных животных и является одной из стандартных моделей для оценки антиаритмической активности фармакологических препаратов [26]. В связи с низкой скоростью проникновения SkQ1 в митохондрии применяли предварительное введение препарата.
Материал и методы
На крысах-самцах Wistar массой 330—400 г выполнены 2 серии опытов. Первая серия была выполнена на крысах, содержавшихся в виварии РКНПК, вторая — на крысах Wistar, содержавшихся в виварии НИИ Митотехнологии МГУ. В первой серии крысы в течение 2 нед получали с пищей субстанцию SkQ1 (дозы в разных группах были в диапазоне 0,02—2,0 нмоль/кг/сут). В качестве контроля использовали крыс, получавших аналогичное количество NaBr. Во второй серии крысы также в течение 2 нед получали субстанцию SkQ1 через желудочный зонд (дозы в 2 группах были 2 или 20 нмоль/кг/сут). Всем крысам под кетаминовым наркозом (100 мг/кг) вставляли катетеры в сонную артерию и яремную вену и после периода стабилизации вводили адреналин (10 мкг/кг). Регистрация среднего артериального давления (САД) и ЭКГ происходила в течение 30 мин на полиграфе Biograph-4 (Cанкт-Петербургский госуниверситет аэрокосмического приборостроения). Запись на компьютер выполняли с помощью аналого-цифрового преобразователя USB 6210 (National Instruments, США) и программы Data Acquisition, модифицированной д.б.н. Е.В. Лукошковой для обработки физиологических сигналов. Анализировали качественный состав аритмий согласно международной классификации [27]; помимо подсчета общего количества экстрасистол учитывали групповые экстрасистолы. Для оценки степени тяжести аритмии вычисляли индекс аритмии, суммируя количество одиночных экстрасистол (1 балл), бигеминию (2 балла), групповых экстрасистол (3 балла) и желудочковую тахикардию (4 балла).
Результаты
В первой серии опытов образованы группы животных, получавших SkQ1 в различных дозировках. В связи с тем, что опыты выполняли в различное время года, к каждой из групп был соответствующий по возрасту и массе контроль. Результаты контрольных групп оказались примерно одинаковыми и были объединены. Аритмия возникала уже на первых минутах после введения адреналина, когда САД повышалось, а частота сердечных сокращений (ЧСС) снижалась (рис. 1). Примерно через 5 мин после введения САД и ЧСС стабилизировались на сниженном уровне, и аритмия прекращалась. Аналогичная динамика была характерна и для животных, предварительно получавших SkQ1. При этом подъем САД в контрольной группе происходил до 158±2 мм рт.ст. (в среднем на 19±2%) уже на 1-й минуте, а ЧСС падала до 251±10 уд/мин (в среднем на 44±2%) несколько позже — на 2-й минуте. При корреляционном анализе не было отмечено зависимости между величиной или степенью изменения САД и ЧСС, т.е. разброс данных каждого показателя был небольшим.
Рисунок 1. Динамика САД (верхняя кривая, мм рт.ст.) и ЧСС (нижняя кривая, уд/мин) до и после введения адреналина (10 мг/кг) в типичном опыте контрольной группы.
Ось абсцисс — шкала времени (интервал 3 мин). САД — среднее артериальное давление; ЧСС — частота сердечных сокращений.
В группах, получавших SkQ1, как исходные величины, так и степень изменения после введения адреналина, не отличались от контроля (см. таблицу). Однако интенсивность аритмии в этих группах была различной и зависела от дозы препарата. Дозы 0,5 и 2,0 нмоль/кг статистически значимо снижали и общее число экстрасистол, и индекс аритмии в 2—2,5 раза (см. таблицу). Некоторая тенденция отмечена также для дозы 0,1 нмоль/кг, при которой наблюдали достоверное снижение индекса аритмии, но не общего количества экстрасистол. Показатели в группе, получавшей 0,02 нмоль/кг, практически не отличались от контроля. Некоторые животные погибали в ходе опыта от отека легких, в контрольной группе погибла 1/5 часть животных (см. таблицу). В группах, получавших SkQ1, смертность была примерно такой же, лишь группа с дозой 0,5 нмоль/кг отличалась меньшей смертностью — в этой группе погибла лишь одна крыса из 15.
Таблица.Исходные показатели функции сердца и проаритмический эффект адреналина (10 мг/кг) в опытах на крысах первой серии.
Примечание. Дозы SkQ1 приведены в нмоль/кг/сут; n — число опытов, САД — среднее артериальное давление; ЧСС — частота сердечных сокращений; ЭС — экстрасистолы. Данные представлены как M±m. * — р>0,05 по сравнению с контрольной величиной.
Во второй серии опытов доза адреналина была уменьшена в связи с тем, что в первых 4 опытах введение стандартной дозы адреналина (10 мкг/кг) вызывало быструю гибель животных. Уже через 3—4 мин на фоне возникшей аритмии со снижением средней ЧСС в 3—4 раза САД падало ниже 100 мм рт.ст., и животные гибли при явлениях отека легких. В связи с этим в последующих опытах была использована доза адреналина 6 мкг/кг. Изменения САД и ЧСС при этом были аналогичны тем, которые возникали в первой серии при использовании более высокой дозы адреналина: САД повышалось на 23—25 мм рт.ст., а ЧСС снижалась на 140—160 уд/мин. Однако в большинстве опытов контрольной группы снижение ЧСС продолжалось, и в результате в среднем по группе ЧСС к 5-й минуте уменьшилась с 466±16 до 220±37 уд/мин, что сочеталось с падением САД с 152±3 до 83±12 мм рт.ст. В результате более 50% животных в этой группе не пережили эксперимент.
Обе группы животных, предварительно получавших SkQ1, были более устойчивы к действию адреналина. Общее количество экстрасистол после введения адреналина в сериях SkQ1 было примерно в 3 раза меньше, чем в контрольной группе (рис. 2). Меньше было и тяжелых форм аритмии, в частности, желудочковая тахикардия — предвестник фибрилляции — наблюдалась в 5 опытах контрольной группы и только в одном опыте из 21, получавших SkQ1. В связи с этим примерно в 3 раза были снижены (р<0,01 для обеих групп) индекс аритмии, а также смертность (см. рис. 2).
Рисунок 2. Число желудочковых экстрасистол, индекс тяжести аритмии (баллы) и смертность (%) в опытах второй серии с введением адреналина (6 мг/кг).
В группах SkQ1 показаны дозировки — 2 и 20 нмоль/кг/сут. Данные представлены как М±m. Все различия показателей в группах SkQ1 статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,01).
Для анализа причин смертности были образованы сводные группы из всех погибших (n=10) и выживших (n=20) животных. Выяснилось, что критичное снижение САД — до 56±12 мм рт.ст. наступало через 5 мин, когда среди выживших животных оно стабилизировалось на уровне 101±5 мм рт.ст. Однако еще раньше, уже через 3 мин, происходило критичное снижение ЧСС — до 220±17 уд/мин, в то время как среди выживших ЧСС стабилизировалась на уровне 298±16 уд/мин. Это позволило предположить, что причиной острой сердечной недостаточности является именно брадиаритмия. В этих группах был подсчитан индекс аритмии, его величина у погибших составила 83±14, а у выживших — 23±5 (р<0,001).
Обсуждение
Аритмия закономерно возникает при действии на сердце адреналина в повышенной концентрации как при струйном [6], так и при болюсном введении [4]. При болюсном введении действующая концентрация адреналина больше, поэтому возникает не только аритмия, но и повышение АД. Это облегчает возникновение эктопических очагов возбуждения в желудочках вследствие барорефлекторного торможения синусного узла (см. рис. 1). В некоторых опытах это торможение было столь сильным, что сопровождалось снижением АД ниже критического уровня, значительным усилением аритмии, в результате чего животные погибали. Вероятно, по этой причине струйный способ, при котором действующая концентрация адреналина повышается постепенно, является более распространенным [6].
Наши результаты свидетельствуют, что предварительное назначение митохондриального антиоксиданта SkQ1 в довольно широком диапазоне доз (0,5—20 нмоль/кг) снижает интенсивность аритмии, вызванной болюсным введением адреналина. При этом обнаружилась любопытная разница в дозировке адреналина. В опытах первой серии стандартной дозой адреналина была 10 мг/кг, а в опытах второй серии — 6 мг/кг, но при этом во второй серии смертность оказалась выше, чем в первой. Причины такого различия остались невыясненными, возможно, и разный источник популяции, и условия содержания, и способ назначения препарата в той или иной степени могли повлиять на чувствительность к адреналину. Тем не менее результаты, полученные с применением меньшей дозировки, хорошо сопоставимы с данными, которые были получены на прежней партии животных. Так, в первой серии применение SkQ1 в дозе 2 нмоль/кг снижало интенсивность аритмии в 2 раза, а во второй серии — в 2,5 раза.
Повышение устойчивости сердца к передозировке адреналина под влиянием SkQ1 происходило под влиянием наномолярных дозировок SkQ1. Аналогичный эффект при тех же дозировках наблюдали при аритмии, вызванной другими причинами — постишемической реперфузией сердца или воздействием пероксида водорода [23, 24]. При этом следует иметь в виду, что реально действующие дозы препарата в митохондриях должны быть на порядки выше. Помимо того что SkQ1 отличается повышенной липофильностью (коэффициент распределения SkQ между липидом и водой составляет около 20 000:1), наличие положительного заряда заставляет молекулы избирательно накапливаться сначала в клетках, а затем — и в митохондриях с коэффициентом накопления 1000 при Δψ, равном 180 мВ, согласно уравнению Нернста. По расчетам концентрация SkQ1 во внутреннем монослое внутренней мембраны митохондрий должна превышать его концентрацию во внеклеточной среде в 2-108 раз [22]. Поскольку эффективными оказались совсем малые дозы препарата, можно предполагать, что защитный эффект не обусловлен простым связыванием активных форм кислорода, а реализуется вследствие повышения антиоксидантного статуса митохондрий.
Профилактический эффект SkQ1 в уменьшении тяжести вызванной адреналином желудочковой аритмии принципиально совпадает с недавно выполненными исследованиями с применением других антиоксидантов. Предварительное назначение NAC, витамина Е, витамина С или витамина А замедляло наступление вызванной адреналином аритмии и укорачивало ее длительность [28, 29]. При этом снижался уровень малонового диальдегида и аминохрома — продукта окисления катехоламинов. Однако следует заметить, что указанные антиоксиданты расходуются в процессе нейтрализации активных форм кислорода, и для поддержания устойчивости миокарда на должном уровне требуется постоянное их потребление. В отличие от этого, молекула SkQ1 встраивается в мембрану митохондрий и может быть неоднократно восстановлена [22]. Это делает препарат перспективным в плане разработки профилактического лекарственного средства.
