В настоящее время в клинических работах показано, что структурная организация внеклеточного матрикса (ВМ) не только в значительной мере определяет характер пространственной сердечно-сосудистой цитоархитектоники, но обеспечивает и регулирует межклеточное взаимодействие [1, 2]. В этой связи продолжает повышаться интерес к матриксным металлопротеиназам (ММП) — клеточным ферментам, вовлекающим ВМ в процессы структурно-функционального ремоделирования, чаще всего путем деградации цепей коллагена [3]. Экспериментальные [4—6] и клинические [7—9] исследования демонстрируют, что первоначальное ингибирование активности ММП при сердечно-сосудистой патологии приводит к развитию гипертрофии миокарда левого желудочка (ЛЖ). Однако с течением времени высокая активность ММП в миокарде приводит к расширению полостей сердца и развитию сердечной недостаточности (СН) [8, 10]. Таким образом, рост ВМ из фактора компенсации на начальных стадиях становится важным фактором патогенеза постепенно нарастающей хронической сердечной недостаточности (ХСН). Остаются невыясненными вопросы регуляции активности различных ММП, синергично-антагонистические взаимоотношения указанных ферментов с их тканевыми ингибиторами (ТИМП) в процессах повреждения внеклеточного матрикса при ХСН. Имеются лишь немногочисленные и противоречивые данные о влиянии ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и мелатонина на гомеостаз ВМ миокарда при СН.
Цель настоящей работы — исследование влияния периндоприла и мелатонина на реорганизацию соединительнотканного матрикса в миокарде ЛЖ крыс в условиях экспериментальной сердечной недостаточности (ЭСН).
Материал и методы
Исследование проведено на 38 крысах-самцах линии Wistar массой 180—230 г. Контролем служили 5 интактных крыс-самцов. У 33 животных ЭСН моделировали по методике В.И. Инчиной и соавт. (2000 г.) путем подкожного введения в течение 14 сут 0,1 мл 1% раствора мезатона с последующим плаванием до глубокого утомления [11]. Из эксперимента вывели 5 крыс на 14-е сутки ЭСН, 28 подопытных животных с ЭСН были разделены на 4 группы, в каждой в течение 14 сут ежедневно вводили 5 животным 1-й группы подкожно 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 8 крысам 2-й группы подкожно мелатонин («Sigma-Aldrich», США) в дозе 1,0 мг/кг чистого вещества, разведенного в 0,2 мл 0,9% раствора хлорида натрия, 8 животным 3-й группы — периндоприла аргинин внутрь 2 мг/кг («Servier», Франция), 7 крысам 4-й группы одновременно вводили мелатонин и периндоприла аргинин в тех же дозировках, что во 2-й и 3-й группах. На 28-е сутки от начала опыта животных декапитировали под эфирным рауш-наркозом. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным приказами МЗ СССР № 1045 от 06.04.73 г., № 1179 от 10.10.83 г. Миокард ЛЖ контрольных и экспериментальных крыс был подвергнут стандартной однотипной обработке и изучен с помощью световой микроскопии — после окраски парафиновых срезов гематоксилином Майера и эозином, иммуноцитохимических реакций (оценка экспрессии синтеза белков металлопротеиназы-1 (ММП-1), тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (ТИМП-1)) с использованием моноклональных антител и набора реактивов («Spring Bioscience», США), методов морфометрии. Оценку локализации и интенсивности иммунной реакции проводили полуколичественным методом +/+++ в случайно выбранных 20 полях зрения (100%): (–) нет иммунопозитивных кардиомиоцитов (ИКМЦ); (+) легкая, один ИКМЦ; (++) умеренная, более 5 ИКМЦ; (+++) высокая иммунореактивность, почти все КМЦ иммунопозитивны. Морфометрию осуществляли в соответствии со сложившимися принципами системного количественного анализа [12]. Цитологический анализ структурно-функциональной реорганизации мышечной и стромальной частей миокарда осуществляли в условных полях зрения микроскопа OPTIKA B-350 (Италия), микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры ScopeTek DCM 500 (Италия) и программы ScopePhoto с указанной окулярной вставкой при исследовании 20 полей зрения гистологических срезов (об. 40, ок. 20). Для определения объемной плотности (ОП) КМЦ, их ядер и стромы миокарда нами применено наложение квадратной сетки (Pt=225) на микрофотографии гистологических срезов миокарда при стандартном увеличении. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «Statistica 6.0».
Результаты
В миокарде крыс на 14-е сутки моделирования ЭСН отмечалась выраженная оксифильная мозаичность КМЦ. Встречались как интенсивно воспринимающие эозин клетки, которые чаще характеризовались контрактурным типом повреждения, так и слабоокрашенные КМЦ, с разреженной саркоплазмой (рис. 1, см. цв. вклейку). Наблюдался выраженный полиморфизм ядер КМЦ. У животных данной группы манифестировали гемодинамические нарушения: часто встречались венозное и капиллярное полнокровие, лимфостаз, периваскулярный и интерстициальный отек. Отмечалась умеренная инфильтрация стромы миокарда мононуклеарными клетками, скопления их встречались и вокруг сосудов микроциркуляторного русла. Данные морфометрии показали достоверное уменьшение ОП КМЦ и их ядер на 14-е сутки ЭСН и достоверное увеличение ОП стромы более чем в 2 раза по сравнению с контролем (табл. 1).
У животных с ЭСН через 14 сут после ежедневного введения раствора хлорида натрия (1-я группа) в миокарде ЛЖ усиливалась мозаичность окрашивания КМЦ кислыми красителями по сравнению с предыдущим сроком.
Возрастало количество слабоокрашенных (литически измененных) КМЦ, усиливалась фенотипическая гетерогенность КМЦ — чаще встречались как атрофированные, так и гипертрофированные клетки (рис. 2, см. цв. вклейку).
Ткань миокарда выглядела более разрыхленной со значительными участками межмышечного и периваскулярного отека. Вены были расширенными, неравномерно полнокровными. Часто встречались капилляры, заполненные плазмой и эритроцитами. Отмечался спазм интрамуральных артерий, средний слой которых был значительно утолщен. Строма миокарда была диффузно инфильтрирована мононуклеарными клетками, вокруг сосудов нередко регистрировались скопления тучных клеток. Наблюдались участки мелкоочагового кардиосклероза и периваскулярного склероза, а также очаги плазматического пропитывания внеклеточного матрикса.
В миокарде ЛЖ крыс сохранялось достоверное уменьшение ОП КМЦ и их ядер, достоверно возрастала ОП стромы в 3 раза по сравнению с контролем и увеличивалась на 8,7% по объему, по сравнению с 14 сут ЭСН (см. табл. 1).
В миокарде у крыс с введением мелатонина (2-я группа) преобладали КМЦ с неизмененными морфологическими и тинкториальными свойствами. КМЦ в большинстве случаев равномерно окрашивались гематоксилином и эозином, имели вытянутую форму, соединялись друг с другом с помощью вставочных дисков. Встречались участки с умеренными гемодинамическими расстройствами: полнокровные и расширенные капилляры, интрамуральные артерии в состоянии спазма. Строма органа содержала немногочисленные фибробласты, расположенные между мышечными волокнами, периваскулярно и перикапиллярно встречались группы тучных клеток. Оценка данных морфометрии показала незначительное уменьшение ОП КМЦ и их ядер, отмечались недостоверное увеличение ОП стромы по сравнению с контролем и уменьшение ее на 17,1% по объему, по сравнению с 1-й группой (см. табл. 1).
В миокарде у крыс с введением периндоприла аргинина (3-я группа) наблюдался гетероморфизм КМЦ: присутствовали неизмененные КМЦ, клетки с разреженной саркоплазмой, а также группы КМЦ, интенсивно окрашенных эозином. В то же время необходимо отметить, что в миокарде ЛЖ крыс данной экспериментальной серии отмечалось уменьшение зон лизиса саркоплазмы и миофибрилл. По сравнению с 1-й группой значительно реже встречались мышечные волокна волнообразного вида. Наблюдался менее значимый полиморфизм ядер КМЦ, реже выявлялось их смещение в субсарколеммную зону. Имелась тенденция к уменьшению числа гипертрофированных КМЦ. Гемодинамические расстройства в сердечной мышце были выражены умеренно, места со значительным венозным и капиллярным полнокровием встречались реже, что сопоставимо с изменениями в миокарде 2-й группы крыс. Участки с интерстициальным отеком варьировали от слабо выраженного до умеренно выраженного. У животных данной группы недостоверно уменьшалась ОП КМЦ и их ядер, отмечалось увеличение ОП стромы по сравнению с контролем и снижение ее на 15,5% по объему по сравнению с 1-й группой (см. табл. 1).
В миокарде крыс из группы с одновременным введением мелатонина и периндоприла аргинина (4-я группа) чаще наблюдались КМЦ с сохраненными морфологическими и тинкториальными свойствами, как в группе интактных животных. Больше встречалось участков с однородным окрашиванием мышечных структур, реже выявлялись гипертрофированные КМЦ. Наблюдались зоны с незначительными нарушениями гемодинамики: полнокровные и расширенные капилляры, интрамуральные артерии в состоянии спазма. Строма миокарда содержала небольшие очаги инфильтрации мононуклеарными клетками, участки со слабым интерстициальным отеком. В сравнении с предыдущими группами необходимо отметить наличие меньшего количества патологических изменений у крыс 4-й группы как в КМЦ, так и в стромальных элементах.
В миокарде ЛЖ крыс этой группы недостоверно уменьшалась ОП КМЦ и незначительно увеличивалась ОП ядер КМЦ, отмечалось недостоверное увеличение ОП стромы по сравнению с контролем и снижение ее на 19,3% по объему по сравнению с 1-й группой (см. табл. 1).
При иммуноцитохимическом исследовании миокарда ЛЖ у крыс всех групп обнаружены КМЦ с различной степенью активности ММП-1 (по критериям оценки экспрессии ММП-1). У животных контрольной группы чаще встречались КМЦ с умеренной степенью активности ММП-1.
В миокарде на 14-е сутки ЭСН в равном количестве преобладали поля с умеренной и высокой степенью экспрессии ММП-1 (рис. 3, см. цв. вклейку). Значимое снижение активности ММП-1 (рис. 4, см. цв. вклейку) наблюдалось в 1, 3 и 4-й подопытных группах (с введением хлорида натрия, периндоприла аргинина и комбинированного введения периндоприла и мелатонина) по сравнению с контрольной группой и 2-й группой (с введением мелатонина) (табл. 2). При иммуноцитохимическом исследовании ТИМП-1 иммунопозитивные КМЦ также обнаружены во всех группах. Значительное увеличение ТИМП-1-позитивных КМЦ отмечалось на 14-е сутки моделирования ЭСН и во 2-й группе животных с введением мелатонина по сравнению с контролем. Уменьшение активности ТИМП-1 (рис. 5, см. цв. вклейку) наблюдалось в 1-й группе с введением хлорида натрия и в 3-й группе с введением периндоприла аргинина (см. табл. 2).
Обсуждение
В настоящее время ключевую роль в ремоделировании внеклеточного матрикса в сердце отводят семейству ММП [13]. Недавние исследования показали, что ММП гидролизуют не только ключевые белки ВМ, но и многочисленные саркомерные и белки цитоскелета в КМЦ. Целостность ВМ поддерживается равновесием между активностью ММП, регулирующейся на разных уровнях в клетке, и эндогенными ингибиторами, такими как ТИМП и α2-макроглобулин [14]. В нашем исследовании изучены особенности экспрессии в миокарде ММП-1 — интерстициальной коллагеназы, расщепляющей более 40% коллагена ВМ, а также ее тканевого ингибитора (ТИМП-1). При ЭСН происходит существенная реорганизация как КМЦ, так и стромальных элементов миокарда, что согласуется с результатами наших предыдущих исследований [15]. Обнаруженные структурно-функциональные изменения в миокарде ЛЖ, с одной стороны, в виде увеличения доли гипертрофированных КМЦ, с другой — значительные микроциркуляторные нарушения, а также нарастание ОП стромы и ее диффузной инфильтрации мононуклеарными клетками, свидетельствуют об очаговом кардиосклерозе и развитии регенераторно-пластической недостаточности миокарда [16]. Выявленная структурная реорганизация миокарда сопровождается высокой экспрессией ММП-1 и ТИМП-1 в миокарде на 14-е сутки ЭСН. Накопление коллагена в интерстициальной ткани за счет его повышенного синтеза в условиях гипертрофии КМЦ, гипоксии и ишемии при ЭСН на 14-е сутки можно объяснить преобладанием экспрессии ТИМП-1 над активностью ММП-1. При этом есть данные, что ММП-1 является единственным ферментом, способным как инициировать, так и продолжать «поломку» промежуточного коллагена [17].
Обращают внимание продолжающееся увеличение ОП стромы миокарда и существенные морфологические изменения в 1-й группе крыс с ЭСН и введением в течение 14 сут раствора хлорида натрия, что указывает на необратимое ремоделирование соединительно-тканного матрикса. В данной группе наблюдалось снижение активности ММП-1/ТИМП-1, при этом активность ТИМП-1 в соотношении несколько доминировала. Следует отметить, что снижение активности ферментов привело к формированию фиброза поврежденного миокарда. Известно, что КМЦ, миокардиальные фиброциты и эндотелиальные клетки в миокарде экспрессируют один или несколько типов ММП/TИMП, активность которых меняется с типом, этиологией и стадией СН [18]. Однако для определения окончательных тонких механизмов, объясняющих прогрессирование соединительно-тканных нарушений при ХСН, требуются дальнейшие исследования.
Наше исследование продемонстрировало, что под действием периндоприла аргинина выявлялись существенные положительные изменения как в структуре КМЦ, так и в строме миокарда при сравнении с 1-й группой; увеличение ОП стромы было незначимо по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибитор АПФ периндоприл воздействует на прогрессирующий рост фиброза при ЭСН, блокируя, на наш взгляд, его основные причины: 1) прогрессирующее повреждение КМЦ; 2) постоянную активацию ренин-ангиотензин-альдостероновой системы. В группе периндоприла сохранялся баланс в отношении ММП-1/ТИМП-1, близкий к таковому в группе интактных крыс, что способствовало стабилизации внеклеточного матрикса. Наши данные согласуются с результатами других авторов [19] и свидетельствуют о благоприятном влиянии ингибиторов АПФ на ремоделирование ВМ при ХСН.
Нами установлено, что под действием мелатонина также отмечался регресс патологических изменений в миокарде, реже встречались участки с интерстициальным отеком, гемодинамическими нарушениями, увеличение ОП стромы было статистически незначимо по сравнению с контрольной группой. Данные факты мы трактуем как защитное действие мелатонина на миокард. Механизм подобной цитопротекции ряд авторов связывают с про- и антиоксидантными свойствами мелатонина [20], его стимулирующим влиянием на продукцию NO-синтазы клетками эндотелия сосудов с последующим увеличением продукции оксида азота и вазодилатацией [21, 22]. В группе мелатонина отмечалась более высокая экспрессия ТИМП-1 в сравнении с ММП-1. Ряд авторов предполагают [17], что повышение экспрессии ТИМП-1 при росте интерстициального фиброза является благоприятным фактором, препятствующим дилатации ЛЖ и развитию систолической дисфункции. Основываясь на наших наблюдениях и данных других исследователей [23], можно констатировать положительное регулирующее влияние мелатонина на соотношение ММП и ТИМП при ХСН.
В миокарде у крыс с ЭСН и комбинированным введением периндоприла и мелатонина отмечалась выраженная положительная динамика при анализе морфометрических данных миокарда, значимо уменьшалась ОП стромы на 19,3% по объему, сохранялись незначительные нарушения гемодинамики по сравнению с 1-й группой, что соответствовало умеренной активности как ММП-1, так и ТИМП-1. Разные механизмы цитопротекции периндоприла и мелатонина при сочетанном применении демонстрируют клинически значимую терапевтическую эффективность данной комбинации на реорганизацию ВМ в миокарде ЛЖ крыс в условиях ЭСН.
Заключение
Таким образом, наше исследование продемонстрировало роль матриксной металлопротеиназы-1 и ее тканевого ингибитора как важных биологических маркеров кардиоваскулярного ремоделирования при сердечной недостаточности и значение использования при этом периндоприла и мелатонина — препаратов с кардиопротективным воздействием на внеклеточный матрикс, создающих необходимые условия для адекватной активации компенсаторных механизмов в миокарде.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 11-04-97000 р_поволжье_а).
