Традиционно функция тромбоцитов рассматривается через призму первичного гемостаза, направленного на быстрое прекращение кровотечения при повреждении сосудистой стенки. Однако тромбоциты несут ответственность за тромбогенез в местах разрыва атеросклеротической бляшки, способствуя возникновению острого коронарного синдрома, ишемического инсульта и заболеваний периферических артерий [1—3]. Пуриновые рецепторы тромбоцитов играют ведущую роль в гемостазе и тромбогенезе, что послужило основанием для разработки методов антиагрегантной терапии [4—6]. Тромбоциты экспрессируют пуриновые рецепторы 3 подтипов — P2X1, P2Y1 и P2Y12. Причем P2X1 являются регулируемыми лигандом неселективными катионными каналами, тогда как рецепторы P2Y, сопряженные с белками G (GPCR), включают различные внутриклеточные сигнальные пути [7].
Рецепторы Р2Х1
Экспрессия рецепторов P2Х1. Рецепторы P2Х1 представлены на клетках сердца, нейронах и глиальных клетках центральной нервной системы, гладких мышечных клетках кровеносных сосудов и мочевого пузыря, остеобластах, тромбоцитах и других клетках [8—10]. Животные с дефицитом экспрессии P2X1 демонстрируют нормальное, хотя и вариабельное, время кровотечения, однако имеют повышенную резистентность к тромбогенезу [11]. Мыши с гиперэкспрессией рецепторов P2X1 тромбоцитов проявляют склонность к тромбогенезу в ответ на инъекции коллагена и адреналина [12].
Лиганды и сенситивность P2Х1 рецепторов. Описано 7 изоформ рецепторов P2X (P2X1—P2X7) [13], причем каждая изоформа состоит из 2 трансмембранных доменов, цитоплазматических амино- и карбоксильных концов и большой внеклеточной лигандсвязывающей петли [14]. В мегакариоцитах и тромбоцитах человека экспрессированы рецепторы Р2Х1 [15]. Агонистом рецепторов Р2Х1 является аденозинтрифосфат (АТФ), секретируемый из гранул стимулированных тромбоцитов, а также выделяемый из поврежденного эндотелия и эритроцитов при снижении парциального давления кислорода. АТФ может непосредственно связываться с рецепторами P2X1 и не активирует рецепторы P2Y [13]. Рецепторы P2X1 обладают высокой проницаемостью для ионов Ca2+ (относительная проницаемость канала для Са2+ в 3,9 раза выше таковой для Na+) [16]. Тем не менее деполяризация мембраны тромбоцитов усиливает кальциевую сигнализацию при активации других рецепторов, сопряженных с G-белками, на поверхности мегакариоцитов и тромбоцитов. Не исключено, что деполяризация мембраны после активации рецепторов P2X1 потенцирует кальциевую сигнализацию, поскольку вызывает активацию фосфолипазы С (ФЛС) и рецепторов к инозитол-3-фосфату (IP3) ниже белка Gq [17]. Кроме того, повышение мобилизации Ca2+ при активации рецепторов P2X1 может привести к увеличению секреции плотных гранул, что, в свою очередь, усиливает агрегацию тромбоцитов.
Рассматривают несколько вариантов модуляции активности рецептора P2X1. Первый вариант опосредован участием протеинкиназы С (ПКС), стимулируемой через рецептор P2Y1 и белок Gq-сигнальный путь [18]. Второй вариант модуляции определяется механизмами функционирования липидных щелей. Последние обеспечивают предварительное формирование комплексов рецепторов и сопряженных с ними систем сигнализации в клетке. Как выяснилось, в тромбоцитах более 80% рецепторов P2X1 находится за пределами липидных щелей [19]. Это определяет высокую мобильность рецепторов P2X1, примерно 75% рецепторов перемещаются в плазмолемме тромбоцита в течение 5 мин [20]. При максимальной концентрации агониста десенситизация рецептора P2X1 наступает в течение нескольких секунд [19]. А в основе реализации механизмов десенситизации лежат процессы интернализации и утилизации рецепторов. Механизмы рециркуляции рецепторов Р2Х1 в мембране тромбоцита во многом остаются невыясненными. Можно лишь констатировать участие в этом процессе ионов Са2+ и ряда внутриклеточных белков [20].
Молекулярные механизмы функционирования рецепторов P2X1 и их взаимодействия с другими сигнальными системами. Селективная активация рецепторов P2X1 вызывает быстрое и обратимое изменение формы тромбоцитов, транзиторную централизацию гранул, низкий уровень inside-out-активации αIIbβ3 интегрина, который приводит к слабой обратимой агрегации и формированию малых микроагрегатов [19].
Основная роль активации рецепторов P2X1, очевидно, связана с амплификацией ответа тромбоцитов, вызванного низкими концентрациями других агонистов. Наибольшее влияние рецепторов P2X1 на функцию тромбоцитов выявлено при инкубации их с низкой концентрацией коллагена [21]. В этих условиях происходят освобождение АТФ из гранул и последующая стимуляция рецепторов Р2Х1 [22]. Однако при высокой концентрации коллагена (2,5 мкг/мл) рецепторы P2X1 не принимают существенного участия в агрегации тромбоцитов. Описанная парадигма распространяется также на эффекты тромбина, адреналина, тромбоксана А2 (ТХА2). Так, активация рецептора P2X1 усиливает агрегацию тромбоцитов человека при стимуляции подпороговой дозой тромбина или пороговой дозой TRAP1 (thrombin receptor activating peptide). Как именно P2X1 сигналы сопряжены со стимуляцией других рецепторов тромбоцитов или с inside-out-активацией αIIbβ3, остается неясным. Главным кандидатом на эту роль считается CalDAG-GEFI (Ca2+ and diacylglycerol (DAG)-regulated guanine nucleotide exchange factor I) [20]. CalDAG-GEFI является внутриклеточной сигнальной молекулой, участвующей в активации малых зависимых от гуанозинтрифосфата белков Rac [19].
Таким образом, рецепторы P2X1 тромбоцитов играют важную роль в гемостазе, способствуя усилению сигналов при действии разных стимулов, включая коллаген. Логично, что в настоящее время данный вид пуриновых рецепторов стал рассматриваться в качестве мишени при разработке новых методов антитромбоцитарной терапии. Перспективными в этом отношении могут оказаться ингибиторы одной из разновидностей белков теплового шока — HSP90 [23]. Так, селективный ингибитор HSP90 (гелданамицин) примерно на 90% снижает сенситивность рецепторов P2X1. Этот эффект связан с уменьшением экспрессии данного вида рецепторов на поверхности тромбоцитов, что сопровождалось снижением внутриклеточного уровня Са2+ на 40—45%. Данные исследования показывают, что ингибиторы HSP90 могут быть столь же эффективными в регуляции рецепторов P2X1, как и селективные антагонисты рецептов.
Внутриклеточная сигнализация, сопряженная с активацией P2Х1 рецепторов в тромбоцитах. Активация рецепторов P2X1 сопровождается входом ионов Са2+ и Na+ в цитоплазму тромбоцита с последующей активацией сигнальных путей, усиливающих эффекты основных агонистов, регулирующих функцию тромбоцитов: адреналина (адренорецептор α2А), тромбина (рецептор PAR-1), тромбопоэтина (рецептор c-Mpl), АДФ (рецептор P2Y1), коллагена (рецептор GPVI), фактора Виллебранда (рецептор GP Ibα), ЛПС (рецептор Toll-like 1/2). При этом секреция АТФ из плотных гранул способствует дальнейшему росту концентрации Са2+ в тромбоците [24, 25]. Ключевая роль Са2+ в индуцированной P2X1 сигнализации подтверждается способностью хелатора ионов Ca2+ (BAPTA) блокировать или значительно ингибировать ряд основных ответов тромбоцитов, в том числе inside-out-активацию αIIbβ3, прокоагулянтную активность и продукцию арахидоновой кислоты [19]. Внутриклеточный Ca2+ посредством кальмодулина активирует MLCK (кальмодулинзависимая киназа легкой цепи миозина), в результате чего образуется фосфорилированная форма MLC-P. Последняя вызывает реорганизацию цитоскелета тромбоцита, что лежит в основе изменений формы и экзоцитоза гранул [26]. Селективная стимуляция рецепторов P2X1 также вызывает транзиторное фосфорилирование ERK2 (киназа, регулируемая внеклеточными сигналами), члена семейства МАРК (митогенактивируемая протеинкиназа) с участием ПКС. Основная роль ERK2 в активации рецепторов P2X1, вероятно, заключается в повышении агрегации при низких и умеренных концентрациях коллагена [27].
Рецепторы P2Y1
Экспрессия рецепторов P2Y1. Рецепторы P2Y1 представлены на клетках сердца и кровеносных сосудов, яичка и предстательной железы, а также нервной ткани и форменных элементах крови. В расчете на один тромбоцит экспрессируется около 150 P2Y1 рецепторсвязывающих сайтов [28], что является очень низким по сравнению, например, с рецепторами для ТХА2 или PAR-1 для тромбина (от 1000 до 2000 сайтов на тромбоцит). В эндотелиальных клетках сосудов рецепторы P2Y1 способствуют активации миграции эндотелиальных клеток [29].
Лиганды и сенситивность рецепторов P2Y1. Физиологическим агонистом рецепторов P2Y1 является аденозиндифосфат (АДФ), тогда как АТФ взаимодействует с рецепторами данного типа слабо [19]. Эндогенным антагонистом рецептора P2Y1 является пальмитоил-КоА, который ингибирует индуцированную АДФ агрегацию тромбоцитов и экспрессию Р-селектина [30]. Сенситивность рецептора P2Y1 быстро и обратимо модулируется, во многом благодаря их рециркуляции. Перемещение рецепторов P2Y1 в мембране происходит медленно и регулируется нексином-1 (SNX1), тогда как деградация рецептора является независимой от SNX1 [31].
Молекулярные механизмы функционирования рецепторов P2Y1 и их взаимодействия с другими сигнальными системами. Рецептор P2Y1 обладает классической структурой рецептора, ассоциированного с G-белком. Два Arg-остатка в карбоксильной области домена рецепторов P2Y1 участвуют в активации Gq [32]. Рецептор P2Y1, связанный с белком Gq, вызывает мобилизацию ионов Са2+ из внутриклеточного депо, в результате чего изменяется форма тромбоцита и появляется слабая обратимая агрегация в ответ на АДФ [33]. Рецепторы P2Y1 являются обязательными участниками индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов. Фармакологическое ингибирование рецепторов P2Y1 или их генетический дефицит не сопровождается изменением формы в ответ на АДФ, поскольку отсутствует должное повышение внутриклеточного Са2+. У мышей с генетическим дефектом экспрессии рецепторов P2Y1 наблюдается длительное кровотечение вследствие нарушения тромбогенеза [34]. Рецептор P2Y1 участвует в агрегационном ответе на коллаген, а также действии подпороговых концентраций ТХА2 и агонистов PAR.
Ингибирование P2Y1-рецепторной сигнализации возможно при использовании антагонистов нуклеотидных рецепторов P2Y12 и А2А [9, 35]. Вероятно, это происходит в результате межмолекулярной передачи сигнала и конформационных изменений между компонентами гетеро-олигомеров, образуемых этими тремя рецепторами.
Внутриклеточная сигнализация, сопряженная с активацией рецепторов P2Y1. P2Y1-рецепторопосредованная стимуляция Gq приводит к активации фосфолипазы Сβ2 (ФЛСβ2), небольших белков G RhoA, киназ Rac и Src [36]. ФЛCβ2 является основной сигнальной молекулой, расположенной в нисходящем каскаде белка Gq, которая катализирует гидролиз 4-фосфатидилинозитол,5-бифосфата (PIP2) в IP3 и диацилглицерол (DAG). Эти промежуточные продукты сигнализации вызывают высвобождение ионов Са2+ и активацию ПKC [37].
Рецепторы P2Y12
Экспрессия P2Y12 рецептора. Рецептор P2Y12, ген которого представлен на хромосоме 3q21—q25, присутствует в тромбоцитах, эндотелиальных клетках, глиоцитах и гладких мышечных клетках сосудов [37]. Два связанных N-сайта гликозилирования на внеклеточных аминокислотных остатках могут модулировать деятельность данного рецептора [38]. Рецепторы P2Y12 существуют преимущественно как гомо-олигомеры, расположенные в липидных щелях. При действии активного метаболита клопидогрела, ингибирующего функции P2Y12, гомо-олигомеры разрушаются на нефункционирующие димеры и мономеры, которые поглощаются за пределами липидных щелей [7, 39].
Дефект этого рецептора выявляется у пациентов с избирательным нарушением активации тромбоцитов на АДФ [40]. Полиморфизм гена рецептора P2Y12 может внести значительный вклад в вариабельность ответа тромбоцитов на антиагрегантные препараты [41]. Генотипированы 5 гаплотипов метки htSNPs, охватывающей все гены рецептора P2Y12, (rs6798347C>t, rs6787801T>c, rs9859552C>a, rs6801273A>g и rs2046934T>c [T744C]). Минорный аллель С SNP rs6787801 связан с 5% уменьшением ответа на АДФ, тогда как гомозиготы Аа SNP rs9859552 — с 20% снижением ингибирования агрегации тромбоцитов по сравнению с гомозиготами CC.
Различная экспрессия рецептора P2Y12 может лежать в основе половых различий по частоте развития сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку половые гормоны оказывают влияние на их экспрессию в мегакариоцитах [42, 43]. Исследование влияния тестостерона и 17β-эстрадиола на экспрессию генов рецепторов P2Y12 проведено на мегакариоцитарной клеточной линии DAMI. Уровни мРНК белка рецептора P2Y12 возрастали под влиянием тестостерона в зависимости от дозы, в то время как 17β-эстрадиол не влиял на экспрессию гена. Опосредованная тестостероном экспрессия P2Y12 подавлялась как на транскрипционном, так и трансляционном уровнях при блокаде андрогенных рецепторов. Инкубация мегакариоцитов с тестостероном также сопровождалась снижением фосфорилирования VASP (Vasodilator-stimulated phosphoprotein) и отменялось антиандрогеными препаратами [42].
Лиганды и сенситивность рецептора P2Y12. AДФ является естественным агонистом этого рецептора, в то время как АТФ и широкий спектр аналогов АТФ ведут себя как антагонисты [44]. Этот рецептор представляет собой молекулярную мишень антитромбоцитарных препаратов, в частности, тиенопиридиновых соединений, являющихся конкурентными антагонистами рецепторов [5]. В этой связи представляет интерес оптимальный уровень блокады рецепторов P2Y12, позволяющий эффективно подавлять функцию тромбоцитов. Для ответа на данный вопрос проведено исследование с тромбоцитами здоровых добровольцев [45]. Для достижения различного уровня блокады рецепторов P2Y12 in vitro использовали активный метаболит Прасугрел (R-138727), а количество рецепторов P2Y12 оценивали путем связывания 33Р-2MeSADP. Блокада рецепторов P2Y12 на 60—80% сопровождалась значительным торможением агрегации тромбоцитов, экспрессии Р-селектина, формирования микрочастиц и фосфорилирования VASP. Интересно, что агрегация тромбоцитов и экспрессия Р-селектина, индуцированные низкой дозой АДФ (2 мкМ), подавлялись даже при невысоком уровне блокады рецепторов. При этом для ингибирования фосфорилирования VASP требовалась блокада не менее 60% рецепторов P2Y12. Максимальное торможение функций тромбоцитов обеспечивалось при 80% блокаде рецепторов P2Y12.
После контакта с AДФ тромбоциты перестают отвечать на повторную стимуляцию данным агонистом. Это рефрактерное состояние тромбоцитов является временным и зависит от активности ферментативной системы деградации AДФ. Считается, что данный феномен связан с селективной десенситизацией и интернализацией рецепторов P2Y1, тогда как рецептор P2Y12 сохраняет активность [46]. Десенситизация определяется фосфорилированием С-терминальных участков рецептора и зависит от взаимодействия β-аррестина-2 и ПКС [47]. При этом сохранение функциональной активности рецепторов P2Y12 обеспечивает поддержание тромбогенеза в месте повреждения сосудистой стенки. Существует и иная точка зрения, согласно которой одновременно десенсибилизации подвергаются рецепторы P2Y1 и P2Y12 [48].
Для нормальной функции тромбоцитов необходимы интернализация и последующий процессинг рецепторов. Функция рецептора P2Y12 нарушается после удаления или мутации 4 аминокислот на С-терминальном конце этого рецептора, в участке локализации PDZ-1 (95/disc large/zonula occludens-1)-связывающего белка [49]. Удаление этой молекулы или мутация одного из ее остатков (P341A) сопровождались не только снижением интернализации рецепторов, но и нарушением их возврата на поверхность плазмолеммы. Таким образом, по сути, происходит блок ресенситизации рецепторов. Физиологическое значение этого феномена в регуляции функций тромбоцитов можно наблюдать у пациентов с гетерозиготной мутацией в PDZ последовательности рецепторов P2Y12 (P341A). Для таких тромбоцитов было характерно снижение экспрессии P2Y12 рецепторов и значительное нарушение их рециркуляции. Полагают, что С-конец этого рецептора обеспечивает направленное движение рецепторов. Важную роль в потенцировании интернализации P2Y12 рецептора играет 1-я изоформа регуляторного фактора Na+/H+ обменника (Na+/H+ exchanger regulatory factor isoform one - NHERF1) [50].
Воспроизводимые биологические эффекты. Рецептор P2Y12 ассоциирован с белком Gi, сигнальный путь которого контролирует ряд биологических процессов, таких как агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ или напряжением сдвига, мобилизация Ca2+ из депо, секреция веществ из α-гранул и плотных гранул, прокоагулянтная активность тромбоцитов, продукция ТХА2, рост тромба и его стабильность, а также различные процессы фосфорилирования белков [51]. Кроме того, сигнальный путь P2Y12 — Gi может привести к активации рецепторов фибриногена и агрегации тромбоцитов путем взаимодействия с сигнальными путями, ассоциированными с белками G12/13 или Gz [52]. Рецептор P2Y12 необходим для завершения агрегации при стимуляции рецепторов P2Y1 [17], а также для реализации зависимого АДФ от усиления агрегации при действии других агонистов (серотонина, TXA2 и тромбина), иммунных комплексов или когда тромбоциты активируются коллагеном через путь GPVI — тирозинкиназа — ФЛCγ2 [53]. Рецептор P2Y12 также вносит вклад в формирование тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов [54, 55], опосредованных экспрессией Р-селектина на поверхности тромбоцитов, в результате чего тканевый фактор экспонируется на поверхности лейкоцитов. Рецептор P2Y12 совместно с рецепторами P2Y1 участвует в формировании микрочастиц, циркулирующих в цельной крови при индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов [56].
Изолированная активация рецепторов P2Y12 не вызывает изменения формы тромбоцитов, но повышает секрецию плотных гранул при действии других агонистов. Доказана роль рецепторов P2Y12, в том числе тромбоцитов, в развитии и прогрессировании атерогенеза [57]. Исследования, проведенные на мышах без рецепторов P2Y12 и аполипопротеина Е, выявили уменьшение площади атеросклеротического поражения, повышение содержания межклеточного вещества соединительной ткани и снижение инфильтрации моноцитами-макрофагами в зоне атеросклеротических бляшек. Проведенная трансплантация костного мозга подтвердила, что экспрессия P2Y12 на тромбоцитах является ключевым фактором развития атеросклероза, хотя нельзя исключить роль этих рецепторов в гладких миоцитах. Рецепторы P2Y12 тромбоцитов за счет ингибирования пути аденилатциклаза АЦ — цАМФ — протеинкиназа А регулируют секрецию тромбоцитарного фактора 4 и, тем самым, влияют на рекрутирование моноцитов в соединительную ткань бляшки. Следовательно, рецепторы P2Y12 модулируют атерогенез, по крайней мере, частично, путем увеличения рекрутирования клеток — участниц воспаления в зону поражения [40, 58].
Внутриклеточная сигнализация рецепторов P2Y12. Рецептор P2Y12 связан с белком Gαi2, который при стимуляции диссоциирует на субъединицы Gα и Gβγ, активирующие различные сигнальные пути [59, 60]. Gαi2 несет ответственность за опосредованное AДФ торможение аденилатциклазы (АЦ) и последующее уменьшение продукции цАМФ. Это приводит к ингибированию ПКС и после каскада сигнальных процессов завершается активацией рецепторов гликопротеина GPIIb/IIIa. Следует отметить, что торможение АЦ не имеет никакой причинно-следственной связи с агрегацией тромбоцитов. Иное дело, что ингибирование АЦ через Gαi2 при действии АДФ может внести существенный вклад в формирование тромбоцитарных агрегатов вследствие ограничения действия простациклина или других веществ, стимулирующих АЦ [61].
Освобождение димеров Gβγ может активировать целый ряд различных клеточных эффекторов, таких как фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), Akt/протеинкиназа В, Rap1b и Rac, семейство Src тирозинкиназ и пр. [62]. Классический сигнальный путь — субъединица βγ активизирует PI3K, которая посредством протеинкиназы Akt способствует активации рецепторов GPIIb/IIIa [63].
Необходимо подчеркнуть, что активация белка Gi, связанного с рецептором P2Y12, имеет большое значение для реализации сигнала с Gq-связанного рецептора, т.е., при стимуляции тромбоцитов АДФ существует взаимодействие белков Gq и Gi. Подтверждение этого положения можно найти в исследованиях [64]. На фоне блокады рецептора P2Y1 при индуцированной АДФ агрегации тромбоцитов регистрировалась вполне ожидаемая отмена ПКС опосредованного фосфорилирования белков. Неожиданностью оказалось, что антагонисты Gi-связанных рецепторов P2Y12 полностью предотвращали активацию ПКС. Следовательно, стимуляция Gq является необходимым, но недостаточным процессом для индуцированой AДФ активации ПКС, поскольку требуется сопутствующее стимулирование белка Gi. Перекрестные связи между Gq и Gi, вероятно, замыкаются на метаболизме DAG, который играет более важную роль, чем ПКС в регуляции агрегации тромбоцитов. В частности, DAG непосредственно стимулирует CAlDAG-GEFI, ответственный за активацию Rap1, причем содержание DAG контролируется DGK (DAG metabolizing enzyme diacylglycerol kinase) [65]. Эффект, сопоставимый со стимуляцией белка Gi, можно достигнуть прямым ингибированием DGK, а непосредственное стимулирование Gi затрудняет превращение экзогенного DAG. Возможно, что когда DAG синтезируется при участии ФЛС, активируемой через зависимый от Gq путь, для его накопления требуется ингибирование DGK через Gi.
Участие рецептора P2Y12 в регуляции активности АЦ остается не востребованным кардиологами. Известно, что ряд антиагрегантов, в том числе эндотелиальный простациклин, подавляет функцию тромбоцитов за счет увеличения внутриклеточного цАМФ. В плане повышения эффективности антиагрегантной терапии при ишемической болезни сердца (потенцирования эффектов, обеспечивающих увеличение цАМФ в тромбоцитах) важным является взаимодействие антагонистов Gi-сопряженных рецепторов (P2Y12 или EP3) и прямых стимуляторов АЦ, сопряженной с Gs [61]. Исследования [66] продемонстрировали, что кангрелор и DG-041 (антагонист EP3) существенно повышают уровень цАМФ. Однако более важно, что кангрелор увеличивает эффективность препаратов, повышающих внутриклеточный уровень цАМФ (ПГI2, илопроста, ПГД2, аденозина и форсколина). Это означает, что эффект антагонистов рецепторов P2Y12 и EP3 можно потенцировать с помощью препаратов, стимулирующих АЦ.
Нельзя исключить, что повышение уровня цАМФ в тромбоцитах при применении антагонистов рецепторов P2Y12 связано с функционированием ранее не известного механизма. Анализ молекулярных механизмов ингибирования активации тромбоцитов человека при блокаде рецепторов P2Y12 двумя препаратами 2MeSAMP (2-methylthioadenosine 5’-monophosphate triethylammonium salt) и ARC69931MX (кангрелор) показал, что оба эти соединения повышали уровень цАМФ тромбоцитов до уровня, существенно ингибирующего агрегацию тромбоцитов. Интересно другое — повышение цАМФ не требовало участия Gi-сигнализации, так как было опосредованно активацией сигнального пути, вероятно, связанного с белком Gs [24].
В реализации эффектов рецепторов P2Y12 принимают участие две основные изоформы фосфоинозитол-3-киназы γ — PI3Kγ и PI3Kβ [7, 59]. У мышей, дефицитных по PI3Kγ, выявлено нарушение агрегации трмбоцитов и активации рецептора фибриногена. Аналогичные результаты наблюдались в тромбоцитах мышей, дефицитных по Gi, и в тромбоцитах, предварительно обработанных антагонистами рецепторов P2Y12 [67]. В совокупности эти исследования подчеркивают важность PI3K в реализации эффекторов рецепторов P2Y12 тромбоцитов.
PI3Kγ реализует свою функцию в P2Y12-рецепторопосредованной активации тромбоцитов двумя способами. Во-первых, посредством Rap1b, который относится к семейству малых ГТФаз, функционирующих через Gi-зависимый путь. Причем связка Rap1 — Rac1 поддерживает функциональную обратную связь для CalDAG — GEFI [62]. При анализе ответов тромбоцитов, контролируемых Rac1, наблюдается: а) нарушение образования ламеллоподий, ретракции тромба и секреции гранул, которое регистрируется как у генетически дефицитных по Rac мышей, так и при ингибировании Rac (EHT 1864); б) снижение выхода Са2+ из депо при ингибировании Rac. Таким образом, Rap1-сигнализация контролирует устойчивую активацию Rac1, что влияет на зависимую от CalDAG — GEFI и P2Y12 активацию Rap1 и участие в мобилизации кальция и секреции АДФ из гранул.
Во-вторых, при стимуляции рецепторов P2Y12 PI3Kγ может активировать Akt (протеинкиназу B), независимо от статуса рецепторов P2Y1 [51]. Фосфорилирование Akt не происходит в тромбоцитах дефицитных по PI3Kγ мышей, а индуцированное Gi Akt-фосфорилирование усиливается через G12/13 путем активации Src-киназ [24]. Следует подчеркнуть, что активация PAR-1 и PAR-4 индуцировала фосфорилирование Akt также зависимым от Gi образом [24]. Необходимо отметить, что путь P2Y12 — PI3K функционирует параллельно с сигнальным путем, запускаемым PAR-4 в процессе стабилизации тромбоцитарных агрегатов [51]. Данное утверждение базируется на том, что блокада рецепторов P2Y12 ограничивала зависимую от PI3K активацию ПКС и, как следствие, снижалась индуцированная PAR-1 агрегация тромбоцитов. Совместная блокада рецепторов P2Y12 и PAR-4 также снижала стабильность индуцированной тромбином агрегации тромбоцитов.
PI3K также является одним из важных внутриклеточных путей, регулирующих зависимую от Gi активацию интегрина αIIbβ3 [7]. Изоформа фермента p110β PI3K обеспечивает активацию интегрина через зависимый от киназ механизм, вовлекающий малую ГТФазу Rap1 и/или серинтреониновый белок киназу B — Akt [37]. Другой сигнальный путь, посредством которого рецептор P2Y12 может модулировать агрегацию тромбоцитов, включает ингибирование фосфорилирования VASP посредством зависимой от цАМФ протеинкиназы А и внутриклеточного актинрегуляторного белка, который является отрицательным регулятором активации интегрина αIIbβ3 [35].
При селективной стимуляции рецепторов P2Y12 и P2Y1 во внутриклеточную сигнализацию могут быть вовлечены Src-киназы [62]. Семейство Src-киназ, включая SFK, оказывает как стимулирующее, так и ингибирующее влияние на активацию тромбоцитов. Механизмы этих, казалось бы, противоречивых эффектов пока неясны. Установлено, что SFK, в основном, Lyn, играет важную роль в стимулировании общего сигнального пути, ведущего к секреции тромбоцитарных гранул. В отсутствие SFK-Lyn или ее ингибировании нарушается секреция плотных и α-гранул тромбоцитов, а также агрегация тромбоцитов, вызванная тромбином, коллагеном и ТХА2 [67]. Данные эффекты отменялись при добавлении АДФ к суспензии тромбоцитов. Селективный ингибитор Src-киназ — PP2 отменял P2Y12-рецепторзависимое фосфорилирование Ser473 Akt. Кроме того, выключение SFK-Lyn снижало индуцированную агонистом активацию Akt и продукцию цГМФ, причем данный эффект устранялся при введении цГМФ в суспензию тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют, что SFK-Lyn стимулирует секрецию тромбоцитов путем активации сигнального пути PI3K — Akt — NO — цГМФ, а также объясняют, почему Src-киназы могут как стимулировать, так и подавлять активацию тромбоцитов.
Большое значение при P2Y12-рецепторопосредованных функциональных реакциях тромбоцитов могут также играть GIRK (G-protein-gated inwardly rectifying potassium channels). К таким реакциям можно отнести необратимую агрегацию тромбоцитов, потенцирование секреции плотных гранул и фосфорилирование Akt, активацию рецептора фибриногена, опосредованное Gq изменение формы тромбоцитов, внутриклеточную мобилизацию Са2+ [24]. GIRK существуют как гомо- или гетеротетрамерные каналы, состоящие из 4 одинаковых или различных субъединиц. Однако эти субъединицы GIRK не связаны с опосредованным Gi торможением АЦ, опосредованным Gqα изменением формы тромбоцитов и внутриклеточной мобилизацией кальция. При использовании различных концентраций блокаторов GIRKs выявлена их роль в индуцированной АДФ стимуляции фосфолипазы А2 и продукции ТХА2 [67]. Эти данные позволяют предположить, что существует два различных функциональных канала GIRK, которые регулируют различные P2Y12-рецепторзависимые ответы.
Приведенный фактический материал, касающийся механизмов сигнализации пуриновых рецепторов, вселяет оптимизм относительно возможности разработки эффективной технологии антиагрегантной терапии при ишемической болезни сердца.
