Роль микрорибонуклеиновых кислот-143/145 в развитии внутристентового рестеноза

Микрорибонуклеиновые кислоты (микроРНК) представ­ляют собой класс олигонуклеотидов, в состав которого вхо­дят 20—25 нуклеотидов. Их основная функция — торможе­ние трансляции сигнала от информационной РНК (иРНК) в процессе синтеза белков на рибосомах, а также в акти­вации системы деградации иРНК [1, 2]. Эти особеннос­ти позволяют микроРНК составлять важные компоненты системы контроля баланса между скоростью пролиферации и дифференцировки клеток в процессе онтогенетического развития органа, а также в процессе канцерогенеза [3, 4]. В настоящее время определены около 600 микроРНК, учас­твующих в регуляции более 50% генов человека, ответствен­ных за синтез различных факторов, присущих клеточному гомеостазу. Поскольку микроРНК вставлены в интроны генов кодирования или в эксоны, их транскрипция зависит от доминантного гена [5].

Имеются доказательства, что экспрессия микроРНК является сложным процессом, в котором участвуют раз­личные рибонуклеазы и эндонуклеазы, нейроэндокрин­ные факторы, цитокины, кемокины. Результаты многих исследований доказывают участие микроРНК-145 и микроРНК-143 в поддержании равновесия между секре­торным (пролиферативным) и сократительным (паттер­ном клеточной дифференциации) фенотипами гладких мышечных клеток сосудов (ГМКС) — в процессах, кото­рые непосредственно влияют на реактивность сосудов, податливость и эластичность сосудистой стенки [6, 7]. Y. Cheng и соавт. (2009) представили доказательства роли микроРНК-145 в формировании неоинтимы в сосуде после его повреждения, и это согласуется с гипотезой, допускающей микроРНК-145 в качестве маркера фено­типа ГМКС [8].

Примечательны в этом отношении исследования L. Elia и соавт. (2009), проведенные на трансгенных мышах knockout, по изучению микроРНК-143 и микроРНК-145. В ходе этих исследований определено нарушение сосу­дистого гомеостаза из-за снижения количества сокра­тительного фенотипа сосудистых миоцитов в результате активации матричных протеиназ и сосудистого ремоде­лирования, свойственного дисфункции эндотелия [9].

Миокардин — основной ген, управляющий диффе­ренциацией сосудистых миоцитов и индуцирующий экс­прессию микроРНК-143 и микроРНК-145, которые могут служить генетическими маркерами ГМКС относительно ее ответа на воздействие инотропных факторов (напри­мер, эндотелина-1), образования сократительных миофиламентов и функционирования систем регулирования метаболизма кальция [7].

Важно отметить, что повреждения сосудов ассоцииру­ются со снижением экспрессии микроРНК-145 и ингибицией миокардина вследствие повышенной экспрес­сии сигнальной молекулы KLF-5 вследствие подавления экспрессии микроРНК-145 [8]. Более того, ключевой фактор, стимулирующий пролиферацию ГМКС, выра­батываемый тромбоцитами (тромбоцитарный β-фактор роста — ТФРβ), был обнаружен в мышиной модели сосу­дистых повреждений и проявил себя как выраженный ингибитор микроРНК-145. Его экспрессия была под­тверждена на сосудистых миоцитах, но не была инди- визуализирована на поверхности эндотелиальных кле­ток сосудов. Доказана его корреляция с генетическими маркерами сократительных белков (актином, миозином, калпомином), что указывает на значимость гладких миоцитов в биологии, регенерации и реактивности сосуда.

Следует отметить, что как ТФРβ, так и ГМКС участвуют в патогенезе формирования и пролиферации неоинтимы, которая является важным звеном в развитии рестеноза коронарной артерии (КА) после ангиопластики, в том числе с использованием внутрикоронарного стента [10]. Коронарная мышечная клетка становится мишенью для пролиферативного и провоспалительного действия цитокинов, освобожденных под стимулирующим влиянием ТФРβ. Миграция и пролиферация сосудистых миоци­тов, способствующие формированию неоинтимы, — про­цессы, свойственные секреторному фенотипу миоцита, который подвергается митогенному воздействию различ­ных циркулирующих факторов (цитокины, эндотелин-1, ангиотензин II) [11]. Таким образом, система контроля и регулирования соотношения секреторного и сокра­тительного фенотипов ГМКС играет определяющую роль в гиперплазии неоинтимы, которая поддерживается избыточной продукцией внеклеточного матрикса и, сле­довательно, непосредственно влияет на риск развития рестеноза после ангиопластики.

Исходя из изложенного была поставлена цель работы: определить экспрессию микроРНК-143 и микроРНК-145 в тканевом содержимом внутристентового рестеноза, а также ее соотношение с содержанием коллагена типа I и коронарных ГМКС с контрактильным фенотипом.

Материал и методы

В образцах ткани, взятых из рестенозированных стентов у 5 умерших пациентов, была определена экспрес­сия микроРНК-143 и микроРНК-145 с использованием морфологических методов [6]. Степень внутристентового рестеноза гистологически была классифицирована как низкая, средняя и выраженная. Образцы тканей изучали методом гибридизации in situдля выявления микроРНК-143 и микроРНК-145 [12, 13], а антитела к α-актину ГМКС, к фибриллярному коллагену типа I или к денатурированному коллагену I применяли для идентификации миоцитов с контрактильным фенотипом и деградации коллагена. Образцы тканей были изуче­ны с помощью конфокальной и иммунофлюоресцентной микроскопии, методов Western blot и Northen blot.

Морфологические исследования были проведены в Лаборатории молекулярной и структурной биологии Института сердца и легких Max-Planck (Bad Nauheim, Германия).

Результаты

Прежде всего следует отметить релевантность метода гибридизации in situдля определения микроРНК в ткани, взятой из рестенозированного стента. В зонах медии и интимы рестенозированной КА обнаружена экспрессия микроРНК-143 (рис. 1, А). Кроме того, в медии выявлен актин — один из сократительных белков гладких миоцитов (рис. 1, Б).

Рисунок 1.Релевантность метода гибридизации in situдля определения микроРНК в ткани, взятой из рестенозированного стента.

А — экспрессия микроРНК-143 в медии и неоинтиме рестенозированной артерии; Б — содержание актина в медии рестенозированной артерии; В — гаадкий миоцит в интиме коронарной артерии при рестенозе; Г — подтверждение методом DAPI наличия клеточных ядер.

Чтобы подтвердить достоверность данных, получен­ных с помощью метода индивидуализации микроРНК в ткани рестеноза, и концептуальное значение этого доказательства, указываем на то, что в ходе использован­ного in situтеста гибридизации отсутствуют артефакты. Иммунофлюоресцентный метод позволяет четко опре­делять клеточные ядра, меченные DAPI, которые свиде­тельствуют о целостности клеток тканевого паттерна рес­теноза (рис. 1, Г). Используя праймеры к микроРНК-143, мы идентифицировали гладкие миоциты в интиме рестенозированного стента (рис. 1, В). Важно отметить, что мышечные клетки неоинтимы меньше в размерах, чем миоциты из зоны медии КА.

Полученные данные показывают, что по мере развития внутристентового рестеноза экспрессия микроРНК-143 уменьшается.

В отсутствие рестеноза выявили значительную экс­прессию микроРНК-143, что сочеталось с содержанием в медии КА большого числа гладких миоцитов (рис. 2, А). Более того, микроРНК-143 не обнаружено в адвентиции артериальной стенки, что указывает на принадлеж­ность этой семьи микроРНК к биологии ГМКС. Следует также отметить наличие очень незначительного коли­чества (которым можно пренебречь) деградированного коллагена в медии и главным образом в адвентиции КА (рис. 2, Б).

Рисунок 2. Высокая экспрессия микроРНК-143 и большое число миоцитов в медии коронарной артерии (А, стрелка) и незначительное содержание денатурированного коллагена типа I в медии и адвентиции (Б, стрелки) в отсутствие рестеноза.

Примечательно, что уже при умеренной степени рес­теноза определяется явное снижение экспрессии микроРНК-143 в зоне медии коронарного сосуда (рис. 3, А). На этом фоне идентифицируется увеличение количества деградированного коллагена (рис. 3, Б). По мере про­грессирования внутристентового рестеноза эти явления становится более выраженными.

Рисунок 3. Снижение в медии экспрессии микроРНК-143 (А, стрелка) и увеличение количества деградированного коллагенатипа I (Б, стрелка) при умеренной степени внутристентового рестиноза.

При резком рестенозе в медии и неоинтиме сегмента КА отмечается дальнейшее увеличение числа гладких миоцитов с секреторным фенотипом, которые не экс­прессируют микроРНК-143 (рис. 4, А), а также коли­чества деградированного коллагена типа I (рис. 4, Б). Выраженное снижение содержания микроРНК-143 обна­руживается как в медии, так и в неонтиме.

Рисунок 4. Выраженный внутристентовый рестеноз.

Одним из морфологических признаков развития ресте­ноза является уменьшение соотношения коллагена типа I (фибриллярный) к денатурированному коллагену на фоне количественного снижения микроРНК-143 и коронар­ных миоцитов с сократительным фенотипом. Степень снижения содержания фибриллярного коллагена типа I и увеличения деградированного коллагена растет в ходе развития рестеноза (рис. 5, см. цв. вклейку). Так, при выраженном внутристентовом рестенозе отмечается мас­сивная деградация коллагена типа I в медии вплоть до его исчезновения, что сопровождается значительным накоп­лением деградированного коллагена (см. рис. 5, K—М, см. цв. вклейку). Если в нормальном сосуде соотношение между денатурированным коллагеном I и коллагеном I фибриллярным составляет около 0,5, то при выраженной степени рестеноза этот показатель увеличивается в 20 раз, составляя в среднем 12,4.

Концептуально важно подчеркнуть, что количествен­ные изменения, подобные микроРНК-143, были обнару­жены и по отношению к микроРНК-145 (рис. 6). В медии нормальной КА (см. рис. 6, А) выявляется снижение количества микроРНК-145 уже при умеренной степени рестеноза, которое становится более значительным при резком рестенозе (см. рис. 6, Б).

Рисунок 6. Экспрессия микроРНК-145 в медии нормальной коронарной артерии (А) и снижение экспрессии микроРНК-145 при средней степени и выраженном рестенозе (Б).

Таким образом, развитие внутристентового рестеноза после ангиопластики сопровождается снижением содер­жания микроРНК-143 и микроРНК-145 в медии КА, что сопровождается явлениями, характерными для фор­мирования неоинтимы: уменьшением числа миоцитов с контрактильным фенотипом и активацией деградации фибриллярного коллагена I типа.

Обсуждение

Один из ключевых механизмов формирования и про­лиферации неоинтимы, что представляет собой морфо­логический субстрат внутристентового рестеноза, связан с дисфункцией эндотелия и нарушением системы конт­роля фенотипа гладких миоцитов КА [11, 14]. В отличие от нормальных сосудов, в интиме рестеноза появляются коронарные миоциты, уменьшенные в размере и име­ющие синтетический фенотип. Миграция мышечных клеток из медии к эндотелию находится под контролем различных локальных систем. Одна из них представлена пассивным барьером внеклеточной матрицы, состоящей из коллагена. Вторая основана на функционировании микроРНК-143 и микроРНК-145, которые поддерживают сократительный фенотип зрелых ГМКС и противостоят действию факторов, способствующих их превращению в секреторных миоцитах, предрасположенных к миграции пролиферации. В этом контексте предполагалось участие микроРНК-143 и микроРНК-145 в патогенезе формиро­вания неоинтимы и внутристентового рестеноза, в связи с чем исследовали их экспрессию в тканевом паттерне рестеноза, взятом у умерших пациентов. Кроме того, мы определяли маркер сократительных миоцитов актина, как и степень деградации коллагена типа I в медии и в неоин­тиме. Полученные данные четко указывают на снижение количества микроРНК-143 и микроРНК-145 в прямой зависимости от степени рестеноза. Более того, умень­шению экспрессии микроРНК соответствует снижение содержания актина, а также фибриллярного коллагена I типа; при этом отмечается увеличение содержания деградированного коллагена типа I в медии и интиме. Следовательно, уменьшение экспрессии микроРНК-143 и микроРНК-145 в медии КА может быть рассмотрено как важный механизм приобретения миоцитами синте­тического фенотипа и их миграции к интиме — процесс, поддерживаемый деградацией внеклеточного коллагена. Последнее явление может быть, в частности, следствием освобождения мышечными клетками протеиназ (прежде всего коллагеназы, MMP-9), которые приводят к расщеп­лению фибриллярного коллагена внеклеточного матрик­са из различных зон стенки сосуда. Механизмы, кото­рые могут вызвать снижение экспрессии микроРНК-143 и микроРНК-145, остаются невыясненными. Поскольку миграция гладких миоцитов и пролиферация неоинтимы ассоциируются с активацией как местной, так и генера­лизованной системы ангиотензина, можно предположить роль ангиотензина II в этом процессе. Знание механиз­мов, которые контролируют экспрессию микроРНК-143 и микроРНК-145, является важным в силу возможно­го их моделирования различными фармакологическими средствами, что позволит значительно снизить риск раз­вития рестеноза КА после ангиопластики. Перспектива этого подхода определена и тем, что в эксперименте уве­личением экспрессии микроРНК-145 под воздействием аденовируса удалось предупредить формирование неоин­тимы сонной артерии крысы после баллонной ангиоплас­тики [7]. Другие семьи микроРНК, которые, согласно данным литературы, могут быть вовлечены в процесс ре­стеноза КА, являются микроРНК-21 и микроРНК-221 [15, 16]. В отличие от регрессивной динамики микроРНК-143 и микроРНК-145, их экспрессия при рестенозе повышена и ассоциируется со степенью пролиферации неоинтимы. Проведены исследования на различных видах животных с целью определения возможности улучшения ремоде­лирования миокарда и других тканей путем введения веществ миметического действия на микроРНА [16—18]. А. Care и соавт. (2007) опубликовали результаты, указыва­ющие на роль микроРНК-133 в регуляции гипертрофии кардиомиоцитов [19].

Таким образом, нами впервые на клиническом матери­але установлено уменьшение экспрессии микроРНК-143 и микроРНК-145, которое сопровождается изменением фенотипа гладких миоцитов — снижением экспрессии миоцитов с контрактильным фенотипом и увеличением миоцитов секреторного фенотипа, — явление, которое может быть рассмотрено как важный механизм форми­рования гиперплазии неоинтимы и развития внутристентового рестеноза КА после ангиопластики. Исследование факторов, определяющих снижение микроРНК-143 и микроРНК-145, представляется важным не только в плане их возможного модулирования с целью снижения риска рестеноза, но и выявления новых предикторов его диагностики и прогнозирования.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. Костину С., зав. лабораторией молекулярной и структур­ной биологии Института сердца и легких Max-Planck (Bad Nauheim, Германия) за содействие в реализации мор­фологических исследований.