Основным тромботическим осложнением ишемической болезни сердца (ИБС) является острый инфаркт миокарда (ОИМ), который возникает вследствие развития тромба на месте поврежденной атеросклеротической бляшки. Активация и агрегация тромбоцитов (АТ) — ключевые процессы тромбогенеза. В этой связи разработка методов эффективной антиагрегантной терапии представляется актуальной проблемой кардиологии, если учитывать частоту ре-стенозов и тромбозов коронарных артерий, развивающихся у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС), ИБС, а также после чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ). Остаточная реактивность тромбоцитов (сохранение высокой проагрегантной активности тромбоцитов) на фоне введения клопидогрела и/или ацетилсалициловой кислоты (АСК) в 5 раз увеличивает риск развития осложнений ИБС, что указывает на необходимость исследования причин этого явления [1, 2]. В настоящее время сохранение гиперактивности тромбоцитов при лечении АСК объясняют генетическим полиморфизмом. В этом отношении обращает внимание полиморфизм рецепторов тромбоцитов GPIIIa (PlA). У больных ИБС, которые ежедневно получают низкие дозы АСК, существует значительная и независимая ассоциация между экспрессией аллелей GPIIIa PlA1 и возникновением стойкой гиперактивности [3]. Можно надеяться, что идентификация генов, связанных с развитием резистентности к АСК, будет способствовать выявлению лиц, подверженных риску, однако не приближает к разработке эффективных методов лечения данного феномена.
Оригинальные исследования [4] ответили еще на один вопрос: может ли адренореактивность организма модулировать функцию тромбоцитов у пациентов, получавших АСК при ОИМ. Отмытые тромбоциты, выделенные у пациентов с ОИМ, получавших АСК в течение 48 ч, и больных контрольной группы (не получавших АСК), исследовали in vitro. В качестве стимуляторов АТ использовали арахидоновую кислоту (AК) или AК вместе с адреналином. АТ выявлена у 8 (17,8%) из 45 пациентов, причем частичное торможение тромбоксана А2 (ТхА2) достигало 80—90%. Тромбоциты оставшихся 37 пациентов не реагировали на АК и характеризовались торможением синтеза ТхА2 (превышающим 95% контрольного уровня). Тем не менее этот остаточный ТхА2 являлся критическим для функционального ответа тромбоцитов, о чем свидетельствует полное торможение АТ только в случае блокады рецепторов ТхА2, или при дополнительном введении АСК in vitro. Если тромбоциты этих пациентов одновременно стимулировали адреналином и AК, то у 25 из 37 пациентов регистрировался высокий уровень АТ (в среднем 73%), а синтез ТхА2 увеличивался в 5,5 раза. Оказалось, что фосфатидилинозитол-3-киназа и уровень Са2+ в цитозоле принимают участие в ответе тромбоцитов, вызванном взаимодействием рецепторов, в то время как Rho/p160 (ROCK) или блокада пуринергических рецепторов (P2Y1, P2Y12) не оказывали влияния. Таким образом, остаточная активность циклооксигеназы-1 и повышенная адреналином тромбоксанзависимая стимуляция тромбоцитов могут снизить клинический эффект АСК у больных с ОИМ.
Приведенные факты объясняют интерес к изучению состояния внутриклеточных сигнальных систем, участвующих в реализации эффектов различных агонистов, оказываемых на тромбоциты, поскольку открывается возможность определить новые молекулы-мишени для таргетной терапии при резистентности к АСК.
Спонтанный разрыв атеросклеротической бляшки, повреждение эндотелия или ЧКВ приводят к экспозиции белков адгезии, тканевого фактора и липидов, способствующих адгезии и активации тромбоцитов. Активированные тромбоциты секретируют растворимые медиаторы, такие как аденозиндифосфат (АДФ), ТхА2, фактор активации тромбоцитов (ФАТ), серотонин и др. Эти посредники в свою очередь стимулируют рецепторы GPCRs (G-protein-coupled receptors), которые запускают различные внутриклеточные сигнальные пути, связанные с активацией фосфолипазы С (ФЛC), протеинкиназы С (ПКС) и фосфоинозитол-3-киназы. Образовавшиеся мессенджеры способствуют активации интегрина αIIbβ3, оказывающего существенное влияние на АТ. Два белка — талин и киндлин, которые связываются с различными регионами цитоплазматических доменов интегрина, играют важную роль в повышении сродства интегрина, необходимого для адгезивных взаимодействий тромбоцитов и лейкоцитов [5].
Талин-1 — цитоплазматический белок массой 270 кДа, состоит из глобулярного N-концевого домена и гибкого стержневого домена; домены могут разделяться посредством протеазы кальпаина-2. Головка талина-1 содержит домен FERM (protein 4.1, ezrin, radixin, moesin), включающий 3 подобласти – F1, F2 и F3, в которых имеются участки связывания с цитоплазматическим хвостом интегрина β и филаментозным актином (F-actin). Стержень талина содержит дополнительный интегринсвязывающий сайт, не менее 2 актинсвязывающих участков и несколько сайтов связывания с винкулином [6]. Связывание талина с цитоплазматической областью интегринов β вызывает конформационные изменения в их внеклеточном домене, что увеличивает сродство интегрина к лигандам [7]. Тромбоциты с дефицитом талина-1 (линия мышей Tln–/–, CreloxP) не могут активировать интегрин αIIbβ3 в ответ на любые агонисты, а также не прикрепляются на иммобилизованный фибриноген [8]. Тем самым подтверждается, что талин-1 необходим для αIIbβ3-зависимой «outside-in» («с рецепторов плазмолеммы – на внутриклеточные сигнальные системы») сигнализации, а также для «inside-out» («мессенджеры из клетки – на рецепторы плазмолеммы») сигнализации.
Киндлины представляют собой семейство цитоплазматических белков адгезии, которые связываются с цитоплазматическим хвостом β-интегринов прямо или в кооперации с талином-1 в процессе активации интегрина. Существует 3 изоформы киндлинов млекопитающих: киндлин-1 (также известный как киндерлин и FERMT1), киндлин-2 (или МIG-2) и киндлин-3 (или URP2). Важная особенность киндлинов заключается в наличии домена FERM, который связывается с цитоплазматическим хвостом интегринов β1 и β3. Тромбоциты, выделенные из химерных мышей kindlin-3–/–, не воспроизводят активацию интегринов αIIbβ3 в ответ на любые агонисты, несмотря на экспрессию талина-1; такие тромбоциты не прикрепляются к фибриногену [9]. В последнее время члены семейства киндлинов — белки фокальной адгезии (Focal adhesion kinase, FAK) — также стали рассматриваться в качестве активаторов интегрина, возможно, облегчающего талин-интегриновое взаимодействие [10].
Тромбоциты могут быть активированы широким спектром агонистов, которые классифицируются как сильные и слабые. Тромбин, TхA2 и Convulxin (агонист рецепторов GPVI) считаются сильными агонистами [11], а АДФ, серотонин и адреналин — слабыми агонистами [12]. TхA2 синтезируется эндогенно из АК, которая выделяется из фосфолипидов мембран тромбоцитов с помощью цитозольной фосфолипазы А2 (цФЛА2) [13]. Фосфорилирование серина ФЛА2 в положении Ser505 и ее перемещение в мембраны кальций зависимым путем является важным этапом активации цитоплазматической ФЛA2 [14]. В тромбоцитах фосфорилирование цФЛA2 происходит после стимуляции тромбином, ангиотензином II, адреналином или коллагеном.
Синтез ТхА2 приводит к дальнейшей активации тромбоцитов путем взаимодействия с тромбоксан-простагландиновым (TP) рецептором, связанным с белками Gq и G12/13 [15]. Повышенный уровень TхA2 был обнаружен у пациентов, страдающих ОИМ [16]. Следует признать, что успешное применение у больных с ИБС АСК, которая необратимо ингибирует циклооксигеназу-1 и, как следствие, ограничивает продукцию ТхА2, стало возможным благодаря исследованию внутриклеточной сигнализации тромбоцитов. Тем не менее молекулярные механизмы, участвующие в продукции ТхА2 при действии различных агонистов, во многом остались невыясненными, что ограничивает возможности совершенствования антиагрегантной терапии [17, 18].
Поскольку стимуляция тромбоцитов с высокой и низкой дозами агониста рецептора GPVI в присутствии блокаторов интегрина характеризуется незначительным снижением продукции ТхА2 [19], принято считать, что тромбоциты могут генерировать тромбоксан как интегринзависимым, так и интегриннезависимым образом.
Интегринзависимая продукция ТхА2. Интегрины состоят из α-и β-субъединиц, которые нековалентно связаны друг с другом. Обе субъединицы состоят из больших N-концевых внеклеточных доменов, формирующих глобулярную головку, одиночного трансмембранного домена и короткого хвоста цитоплазматического домена. Тромбоциты человека экспрессируют 3 различных β1-интегрина: α2β1 (коллагеновый рецептор), α5β1 (фибронектиновый рецептор) и α6β1 (ламининовый рецептор); а также 2 β3-интегрина: αIIbβ3 и αvβ3. Хотя интегрин α2β1 и связан с адгезией тромбоцитов к поврежденной сосудистой стенке, доминирующим интегрином на поверхности тромбоцитов является αIIbβ3, который выступает посредником АТ [20].
Интегрин αIIbβ3 представлен 60 000—80 000 копий на поверхности покоящегося тромбоцита, что отражает самую высокую плотность всех мембранных белков тромбоцитов [21]. Мембраны α-гранул тромбоцитов содержат молекулу αIIbβ3, которая встраивается в плазмолемму тромбоцитов в процессе секреции, тем самым увеличивая на поверхности экспрессию интегрина αIIbβ3 на 25—50%. Лигандами αIIbβ3 служат фибриноген, фибронектин, фактор Виллебранда (ФВ), витронектин. Интегрин αIIbβ3 считывает последовательность Arg-Gly-Asp (RGD) в лигандах. Наиболее важной характеристикой интегрина αIIbβ3 является модуляция сродства после его активации. В состоянии покоя тромбоцита сродство αIIbβ3 для фибриногена — основного лиганда АТ, весьма низкий, поэтому наблюдается минимальное его связывание, несмотря на высокий уровень фибриногена в крови. Активация интегрина αIIbβ3 зависит прежде всего от конформационных изменений рецепторов вследствие адгезии тромбоцитов к внеклеточному матриксу, или происходит при действии таких агонистов, как АДФ, тромбин или АК. В обоих случаях происходит передача информации из клетки на внеклеточный домен αIIbβ3, и этот процесс называется «inside-out» сигнализация, которая повышает сродство рецепторов от низкого до высокого. Активация тромбоцитов приводит к заметному увеличению сродства αIIbβ3 к фибриногену. Лиганд, связанный с интегрином αIIbβ3, вызывает различные процессы в клетках, такие как реорганизация цитоскелета в тромбоцитах через «outside-in» сигнализацию [22].
Механизм активации интегринов αIIbβ3 интенсивно изучается, поскольку этот сигнальный путь может стать потенциальной мишенью для разработки новых антитромботических препаратов. Конформационные изменения внеклеточного домена интегрина αIIbβ3 и результирующее сродство модулируются за счет взаимодействия цитоплазматических хвостов. Клеточный контроль активации интегрина обусловливает необходимость передачи сигнала с небольшого цитоплазматического хвоста к большому внеклеточному домену. Точный механизм участия интегрина αIIbβ3 в «inside-out» и «outside-in» сигнализации до конца не выяснен, и функциональное значение белков, связанных с этим процессом, продолжает изучаться [23].
Адаптируя приведенные факты к процессу интегринзависимой продукции ТхА2, можно воспроизвести следующую цепь событий. Адгезия тромбоцитов к внеклеточному матриксу и активация соответствующего рецептора приводят к каскаду внутриклеточных сигнальных процессов («inside-out» сигнализация), обеспечивающих активацию интегринов αIIbβ3 и α2β1. Активированный интегрин изменяет конформацию и связывает поливалентные лиганды, такие как фибриноген и ФВ [24]. Внутриклеточные сигнальные системы, активируемые после связывания лиганда с рецептором фибриногена или ФВ («outside-in» сигнализация), в свою очередь, регулируют адгезию, рост и ретракцию тромба [25, 26]. Сигнализация «оutside-in» вызывает фосфорилирование β3-цитоплазматического хвоста и активацию фосфолипазы С (PLCγ) [27] с последующей стимуляцией каскадов ФЛСβ→Rap1→ MAPKs (mitogen-activated protein kinases), или фосфоинозитол-3-киназы → Akt → ПкG → MAPKs. Ключевой молекулой, модулирующей MAPKs, является Rap1b — представитель семейства белков Ras [28]. Другие сигнальные молекулы, участвующие в сигнализации «оutside-in», представлены протеинтирозинфосфатазой-1B (PTP-1B) [29], протеинфосфатазой 1C (PP1c) [30], Са2+-интегринсвязывающим белком (CIB), протеинкиназой Cβ (PKC-β) [31].
Интегриновая «outside-in» сигнализация, вызывающая активацию Rap1b, играет важную роль в накоплении тромбоцитов на фибриногене и ретракции сгустка [32]. Дефицит Rap1b в тромбоцитах мышей характеризовался снижением активации интегрина αIIbβ3 [33], а также низкой секрецией AДФ и экспрессией Р-селектина при индукции тромбином или коллагеном. Введение низких доз АДФ и/или фибриногена восстанавливало агрегацию в Rap1b дефицитных тромбоцитах. Важно отметить, что нарушения ретракции тромба и накопления на фибриногене дефицитных по Rap1b тромбоцитов не устранялись при добавлении MnCl2, который вызывает «outside-in» сигнализацию в отсутствие интегриновой «inside-out» сигнализации.
Недавние исследования подтвердили роль семейства малых Rap-ГТФаз и в «inside-out» сигнализации, активирующей интегрин, при этом Rap1 входит в состав RIAM (Rap1-GTP-interacting adaptor molecule). RIAM является членом семейства MRL (Mig-10, RIAM и lamellipodin) адаптерных белков [34], которые соединяют Ras-ГТФазу и талин-1. Взаимодействие белков MRL с Rap1-ГТФ и талином-1 опосредует адгезию интегринов β1 и β2 [35]. В тромбоцитах повышенная экспрессия RIAM стимулирует перемещение талина к αIIbβ3 с последующей активацией интегрина [36]. Эти данные свидетельствуют, что одним из ключевых элементов «inside-out» сигнализации является взаимодействие Rap1-ГТФ, RIAM и талина-1, в результате чего талин-1 связывается с цитоплазматическим хвостом интегрина β [37].
В тромбоцитах Rap1b находится под контролем CalDAG-GEFI (Ca2+ and diacylglycerol-regulated guanine nucleotide exchange factor I), который содержит сайты связывания для Ca2+ и диацилглицерола (DAG), а также домен GEF (guanine nucleotide exchange factor) [38]. Важность CalDAG-GEFI была продемонстрирована у дефицитных по CalDAG-GEFI мышей, поскольку отмечалось нарушение АТ в ответ на АДФ и ТхА2, но не на коллаген и тромбин [39]. Различные ответы дефицитных по CalDAG-GEFI тромбоцитов на агонисты свидетельствуют о существовании независимых от CalDAG-GEFI механизмов активации интегрина αIIbβ3. В отсутствие CalDAG-GEFI рецепторов, активируемых протеазами (PAR) 4-го типа, агонист-индуцированная АТ нуждается в сопутствующей стимуляции рецептора P2Y12, связанного с Giα, и активации ПКС. Таким образом, ПКС может запустить альтернативный путь, ведущий к стимуляции Rap1 и активации αIIbβ3. Было высказано предположение, что быстрая, но обратимая активация Rap1 опосредована CalDAG-GEFI, в то время как ПКС поддерживает устойчивую Rap1 активацию посредством освобождения АДФ из плотных гранул [40].
Подтверждение справедливости этой концепции можно обнаружить в исследованиях [41], которые приводят доказательства, что CalDAG-GEFI является ключевой молекулой быстрой Ca2+-зависимой активации тромбоцитов. Причем CalDAG-GEFI посредством активации малых ГТФаз Rap1 вызывает стимуляцию интегрина и ERK (extracellular signal-regulated protein kinase), регулирующей продукцию ТхА2. В свою очередь, активность CalDAG-GEFI зависит от TxA2 и обеспечивает активацию ПКС и секрецию гранул. Последующее включение сигнализации P2Y12 — ПКС индуцирует вторую волну активации Rap1, необходимую для устойчивой активации тромбоцитов и стабилизации тромба. Таким образом, молекула CalDAG-GEFI индуцирует Ca2+-зависимую активацию интегринов, продукцию TxA2 и секрецию гранул. Преимущество активации CalDAG-GEFI над таковой DAG — ПКС, а также различная кинетика активации Rap1 при функционировании CalDAG-GEFI и сигнальных путей P2Y12 — ПКС позволяет рассматривать CalDAG-GEFI как перспективную мишень для антитромбоцитарной терапии [42].
В последнее время внимание исследователей привлекает взаимодействие сигнальных систем, реализующих интегринзависимую и интегриннезависимую продукцию ТхА2. В этой связи особый интерес представляет путь G12/13, который стимулирует продукцию TхA2, даже если сигнализация с интегрина заблокирована. Полагают, что эффект с белка G12/13 опосредуется тирозинкиназами, в частности Syk и с-Srс [43]. Интересно, что эти киназы активируются при «outside-in» сигнализации [44]. Можно предположить, что PAR, активирующие путь G12/13, имеют общие молекулы сигнализации с интегриновым путем. Одним из таких кандидатов является фермент FAK [45]. FAK — белок с молекулярной массой 125 кДа, экспрессированный в мегакариоцитах и тромбоцитах [46]. FAK является фосфорилированной формой на 6 тирозиновых остатках: Y397, Y407, Y576/577,Y861 и Y925 [47]. Суть в том, что путь G12/13 через киназы Rho и SFK активируют FAK. Вниз от интегрина αIIbβ3 также может быть активирована FAK, однако она не зависит от SFK. Последующие исследования показали, что FAK не способствует продукции ТхА2 в цепи реакций ниже интегрина. Более того, ни одна из 3 тирозинкиназ с-Src, Syk или SFK не играет существенной роли в продукции ТхА2 на сигнальном пути, нисходящем от интегрина. Таким образом, общая эффекторная сигнализация для путей G12/13 и интегрина, которая могла бы способствовать продукции тромбоксана, по-прежнему остается неидентифицированной.
Тромбининдуцированная продукция ТхА2. Несмотря на многогранные исследования тромбининдуцированного фосфорилирования ФЛA2 и синтеза TхA2, механизмы внутриклеточной сигнализации, обеспечивающие данный эффект, остаются непонятными. Тромбин — мощный активатор тромбоцитов, формируется на поверхности тромбоцитов через коагуляционный каскад. Тромбининдуцированная продукция TхA2 в тромбоцитах человека зависит от двух активированных G-белком PAR-1 и PAR-4, опосредующих внутриклеточные сигнальные системы [48], и связана с увеличением фосфорилирования цФЛA2. Ряд исследований продемонстрировали, что внеклеточные сигналрегулируемые киназы белка 1/2 (ERK 1/2), которые активируются в ответ на стимуляцию тромбоцитов человека тромбином, являются важным элементом фосфорилирования Ser505 и, следовательно, могут потенцировать активность ФЛA2 [49].
В настоящее время обсуждаются механизмы активации p38 MAP-киназ и их нисходящий поток сигнализации в процессе синтеза ТХА2 при действии тромбина. Ранее установили [50], что AДФ, выделяемый из плотных гранул тромбоцитов с последующей активацией рецепторов P2Y12, а также освобождение TxA2 являются важными посредниками тромбин-индуцируемой активации p38 MAP-киназы. Однако p38 MAP- киназы не способствуют мобилизации ионов Са2+, экспрессии Р-селектина, активации интегрина αIIbβ3 и АТ человека в ответ на тромбин. Более того, p38 MAP-киназа ингибируется цГМФ или цГМФ-зависимой протеинкиназой G. Причем активность протеинкиназы G не стимулируется, а скорее подавляется p38 MAP-киназой в тромбоцитах человека.
В тромбоцитах PAR связаны с сигнальными путями G12/13 и Gi, функционирование которых приводит к АТ [51]. Причем нижерасположенные сигнальные пути белка G12/13 активируют Rho-киназы [52] и семейство Src-киназ (SFKs), которые опосредуют кальций-независимое изменение формы, а также играют роль в потенцировании фосфорилирования протеинкиназы Akt [53] и секреции плотных гранул [54].
Приведенные ниже факты свидетельствуют, что опосредованное PAR фосфорилирование ФЛA2, освобождение АК и продукция ТхA2 в тромбоцитах человека обусловливают необходимость не только интактного сигнального пути Gi, но и участия пуринового рецептора P2Y12. Итак:
- Эффекты PAR значительно ограничивались при использовании антагониста рецепторов P2Y12 — AR-C69931MX и не изменялись при инкубации с MRS2179 — антагонистом рецепторов P2Y1. Данный факт подтверждается результатами исследований на тромбоцитах мышей при введении клопидогрела и тромбоцитах мышей Pearl с нуклеотидным дефицитом, поскольку в обоих случаях активация PAR сопровождалась более низкой продукцией TхA2 по сравнению с контролем. Эти данные свидетельствуют, что индуцированная рецептором P2Y12 сигнализация усиливает продукцию TхA2, опосредованную PAR [55].
- Даже при низких концентрациях тромбина сигнальный путь P2Y12 играет важную роль в АТ, секреции гранул и других внутриклеточных сигнальных каскадах, поскольку антагонист рецептора P2Y12 значительно ограничивает большинство из указанных функциональных реакций [56]. При высоких концентрациях тромбина (1,0 ед/мл) активация тромбоцитов может происходить независимо от сигнального пути P2Y12.
- Исследование В.И. Шевелева и С.Г. Канорского [57] подтвердило, что длительное применение антиагрегантных препаратов обеспечивает снижение риска развития ишемического инсульта, ОИМ или смерти у пациентов с атеросклерозом. Считается, что достижение этого результата стало возможным благодаря ограничению функциональной активности тромбоцитов за счет предотвращения опосредованного рецептором P2Y12 сигнального каскада и снижения количества синтезированного TхA2.
Попытки проникнуть в суть внутриклеточных механизмов, интегрирующих эффекты PAR и рецепторов P2Y12, активирующих синтез ТхА2, привели к переосмыслению роли MAPKs, таких как ERK1/2 и p38MAPK. Известно, что МАРК необходимы для АТ, секреции гранул, входа Са2+ и активации ФЛA2 [58]. Требовалось ответить на вопрос, действительно ли МАРК играют ключевую роль в продукции TXA2? Утвердительный ответ может быть построен на следующей системе доказательств: 1) исследование A. Garcia и соавт. [59] подтвердило, что активация ERK1/2 необходима для продукции TхA2, индуцированной ФВ. Оказалось, что если ERK1/2 заблокировать U0126 — селективным ингибитором МЕК (mitogen-activated extracellular signal regulated kinase), то индуцированная ФВ продукция TхA2 полностью прекращалась; 2) торможение МЕК сопровождается значительным ограничением опосредованного PAR фосфорилирования цФЛA2 и продукции TхA2. Однако необходимо отметить, что торможение МЕК неполностью подавляет опосредованную PAR активацию цФЛА2. Это подтверждается сообщениями о ERK1/2-независимом фосфорилировании цФЛА2 в тромбоцитах человека. Таким образом, активация цФЛA2 может осуществляться как через ERK1/2-зависимый, так и ERK1/2-независимый механизмы.
В этом контексте необходимо ответить на вопрос, могут ли рецепторы P2Y12 модулировать опосредованную PAR продукцию TXA2? Исследование K. Fälker и соавт. [60] свидетельствует, что при блокаде опосредованного рецепторами P2Y12 сигнального пути (посредством AR-C69931MX) или в отсутствие секретируемого АДФ (как в тромбоцитах мышей Pearl) происходит значительное снижение опосредованной PAR активации ERK1/2. А это означает, что рецепторы P2Y12 усиливают опосредованную PAR продукцию TхA2 путем положительной регуляции активности ERK 1/2.
Остается еще один вопрос: что является связующим элементом между сигнальными системами PAR→Gq→ФЛСβ и P2Y12→Giβγ→ERK 1/2?
Известно, что активация ФЛС и повышение внутриклеточного содержания Са2+ имеют существенное значение для фосфорилирования ряда тирозинкиназ. В частности, Са2+ необходим для активации в тромбоцитах Src и ERK1/2 [61]. H. Yin и соавт. [62] показали, что стимуляция Src необходима для продукции TхA2 при активации различных G-белков. Доказана роль активация ФЛС и внутриклеточного Са2+ в опосредованной PAR активации Src-киназы. В частности, оба процесса — торможение ФЛС и снижение внутриклеточного Са2+ — отменяют опосредованную PAR активацию Src. Таким образом, активация Src-киназы после стимуляции PAR положительно модулирует ERK1/2 и, следовательно, может рассматриваться в качестве связующего звена между внутриклеточными сигнальными системами PAR и рецепторов P2Y12.
АДФ-индуцированная продукция TхA2. Исследования показали, что индуцированная АДФ продукция TхA2, во-первых, требует сопутствующей сигнализации с рецепторов P2Y1, P2Y12 и GP IIb/IIIa, причем антагонисты любого из этих рецепторов блокируют продукцию TхA2 [63]. Блокада P2Y1 и P2Y12 рецепторов или рецептора к фибриногену сопровождается торможением активности ФЛА2.
Во-вторых, одновременная активация сигнальных путей Gq и Gi является необходимым условием продукции ТхА2 в тромбоцитах человека. По отдельности серотонин и адреналин, которые стимулируют соответственно пути Gq и Gi, не оказывают существенного влияния на продукцию ТхА2. Известно, что Gq, связанный с рецептором P2Y1, приводит к опосредованному фосфолипазой Сβ изменению формы тромбоцитов, в то время как стимуляция рецепторов P2Y12 сопровождается опосредованным Gi ингибированием аденилатциклазы и каскадом Gβγ, обеспечивающим активацию ФИ-3Kγ [64], Rap1B [65] и GIRKs [66].
В-третьих, «inside-out» сигнализация через рецепторы P2Y1 и P2Y12 имеет большое значение для продукции ТхА2 [67].
В-четвертых, индуцированная АДФ продукция TхA2 является интегринзависимой и реализуется посредством сигнализации «outside-in» через активированный рецептор фибриногена. Сигнализация «outside-in» может вызвать освобождение АК и последующее ее преобразование в ТхА2. При этом образование TхA2 запускает вторую волну АТ и секреции из плотных гранул, воздействуя через связанные Gq рецепторы TP. Секреция АДФ из плотных гранул активирует ряд внутриклеточных сигнальных систем, действуя через связанные с G-белком рецепторы P2Y1 и P2Y12.
Интересную трактовку взаимодействия пуриновых рецепторов P2Y1 и P2Y12 на этапе фосфорилирования ФЛА2 представили C.Y. Kuo и соавт. [42]. Для этого авторам пришлось вернуться к роли GIRK (G-protein-gated inwardly rectifying рotassium сhannels) и проанализировать его нисходящий поток сигнализации. GIRK существуют как гомо- или гетеротетрамерные каналы, состоящие из 4 одинаковых или различных субъединиц; например, GIRK1/4 и GIRK4/4 имеются в сердце, в то время как комплексы GIRK2/3 и GIRK1/2 представлены в мозге. Установлено, что субъединицы GIRK1, 2 и 4 экспрессированы на плазмолемме тромбоцитов человека. Они имеют большое значение для опосредованных рецептором P2Y12 реакций тромбоцитов, таких как активация рецептора фибриногена, АТ, потенцирование секреции плотных гранул и фосфорилирование протеинкиназы Akt [68]. Однако эти субъединицы GIRK не связаны с опосредованным Gi торможением аденилатциклазы, опосредованным Gqα изменениям формы тромбоцитов и внутриклеточной мобилизацией Са2+.
Обсуждая роль GIRK в индуцированной АДФ продукции TхA2, необходимо учитывать следующие факты:
- использование двух структурно различных блокаторов GIRK канала — SCH23390 и U50488H, подтвердило, что GIRK является эффектором для АТ, опосредуемой рецептором P2Y12;
- семейство Src-тирозинкиназ активируется после стимуляции рецептора P2Y12 [69] и является важным элементом продукции TхA2 при активации различных рецепторов [70]. Селективные ингибиторы Src-киназ полностью отменяют опосредованное рецептором АДФ фосфорилирование (Ser505) цФЛA2 и продукцию TхA2, а значит, активация Src-киназ является важным этапом для обоих процессов;
- опосредованная Gi активация Src-киназ отменяется при низких концентрациях блокаторов GIRK;
- избирательное стимулирование белка Gq, связанного с сигнализацией P2Y1, может также активировать Src- тирозинкиназы [71]. Таким образом, Src-киназы, расположенные ниже Gq, могут быть причиной индуцированного АДФ фосфорилирования цФЛA2.
Принимая во внимание эти факты, можно заключить, что активация канала GIRK после стимуляции рецепторов P2Y12 опосредует активацию Src-киназ, которые обеспечивают фосфорилирование ФЛА2 и модулируют продукцию ТхА2.
Возможно, что в реализации АДФ-индуцированной продукции ТхА2 появился новый интересный регулятор — изоформа протеинкиназы C (nPKC) eta [72]. Данная изоформа экспрессируется в тромбоцитах и фосфорилируется 2MeSADP (по Thr-512). Предварительная инкубация тромбоцитов с MRS-2179 (антагонистом рецепторов P2Y1) или YM-254 890 (блокатором Gq) отменяла фосфорилирование nPKCeta. У мышей с генетическим дефектом P2Y1 и Gq АДФ не может активировать nPKCeta в тромбоцитах. Предварительная обработка тромбоцитов с антагонистом рецепторов P2Y12 (AR-C69331MX) не влияла на АДФ-индуцированное фосфорилирование nPKCeta. Дефосфорилирование nPKCeta воспроизводилось «outside-in» сигнализацией при активации интегрина αIIbβ3. Кроме того, у мышей, не имеющих каталитической субъединицы PP1γ серин/треониновой фосфатазы, снижалось дефосфорилирование nPKCeta интегрином αIIbβ3. Таким образом, АДФ активизирует nPKCeta через рецептор P2Y1 и впоследствии дефосфорилируется посредством PP1g-фосфатазы, которая активируется интегрином αIIbβ3. Кроме того, предварительная обработка тромбоцитов eta-RACK пептидом (специфический ингибитор nPKCeta) ингибирует АДФ-индуцированную продукцию ТхА2, но не влияет на АДФ-индуцированную АТ. Следовательно, nPKCeta положительно регулирует агонист-индуцированную продукцию ТхА2, но при этом не влияет на АТ.
Обобщение накопленного фактического материала позволяет наметить возможные пути ингибирования функции гиперактивных тромбоцитов в случае их резистентности к АСК с учетом состояния сигнальных систем, запускаемых при активации основных рецепторов тромбоцитов (α2-адренорецепторов, иммуноглобулин подобного рецептора GPVI, пуриновых рецепторов Р2Y1 и P2Y12, PAR-1, -4 и пр.), которые реализуют и модулируют синтез тромбоксана ТхА2 у пациентов с ИБС.
