Тромботические осложнения — одна из главных причин смертности и инвалидности, приносящих огромный экономический ущерб государству. Наблюдается рост числа больных с высоким риском развития этих осложнений. Применение лекарственных средств из группы пероральных антикоагулянтов — единственный и пока безальтернативный метод профилактики тромбозов, так как доказана их эффективность при первичной и вторичной профилактике тромбоэмболических осложнений у больных с высоким риском их развития (фибрилляция предсердий, протезированные клапаны сердца и т.д.) и, прежде всего, ишемического инсульта [1]. При этом самая большая «доказательная база» эффективности пероральных антикоагулянтов имеется для варфарина [2].
Несмотря на разработанные схемы подбора дозы варфарина под контролем международного нормализованного отношения (МНО), главной опасностью при назначении лекарственных средств из этой группы остается возможность кровотечений, которые развиваются почти в 26% случаев, из них «большие» (т.е. приводящие к смерти, госпитализации или ее продлению) в том числе фатальные — почти в 4,2% [3, 4]. Риск развития кровотечений напрямую зависит от уровня МНО и возрастает в 1,37 раза с каждыми 0,5 единицы его повышения [5]. При этом бессимптомное повышение МНО может происходить не только на этапе подбора дозы варфарина, но и при длительном его применении [4]. Поэтому актуальным представляется изучение факторов, определяющих индивидуальную чувствительность к варфарину. Одним из таких факторов являются генетические особенности пациента.
Известно, что фармакологически активный энантиомер варфарина (S-варфарин) метаболизируется преимущественно изоферментом цитохрома Р450 CYP2C9. Для гена, кодирующего CYP2C9, известны аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3, кодирующие изоформы со сниженной активностью [6]. Другим важным генетическим фактором, обусловливающим изменение индивидуального ответа пациента на терапию варфарином, является генетический полиморфизм 1-й субъединицы витамин К-эпоксидредуктазы (VKORC1) — молекулы-мишени всех пероральных антикоагулянтов в том числе варфарина [6]. В настоящее время доказана ассоциация аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3, а также генотипа G-1639(3673)АА по локусу VKORC1с низкими подобранными дозами варфарина при различных заболеваниях: у больных с протезированными клапанами сердца [7, 8], постоянной формой фибрилляции предсердий [9, 10], антифосфолипидным синдромом [11], тромбофлебитами [12]. В ряде работ также продемонстрирована ассоциация указанных генетических особенностей с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции и кровотечений [9]. На основании результатов этих исследований были разработаны различные алгоритмы расчета начальной дозы варфарина, базирующиеся на фармакогенетическом тестировании [10, 13—16]. Мы полагаем, что для российских больных оптимальным фармакогенетическим подходом к расчету начальной дозы варфарина является алгоритм Gage [14]. Таким образом, использование персонализованного подхода к дозированию варфарина, основанного на результатах фармакогенетического тестирования, может способствовать развитию более стабильного антикоагулянтного эффекта и снижению риска геморрагических осложнений на фоне лечения варфарином. Однако внедрение фармакогенетического тестирования в клиническую практику невозможно без получения результатов проспективных исследований, подтверждающих преимущества данного подхода перед традиционным, которые не проводились ранее у российских пациентов.
Целью исследования явилась оценка преимуществ фармакогенетического подхода к дозированию варфарина по сравнению с традиционным методом с целью повышения эффективности и безопасности применения этого препарата у больных с высоким риском развития тромбоэмболических осложнений.
Материал и методы
В проспективное исследование включали больных с такими диагнозами, как постоянная форма фибрилляции предсердий, тромбоз глубоких вен нижних конечностей, а также пациентов с искусственными клапанами сердца в отсутствие противопоказаний к применению варфарина. Всем больным перед началом терапии варфарином проводили фармакогенетическое тестирование, на основании результатов которого, а также информации о поле и возрасте рассчитывали начальную дозу лекарственного средства по алгоритму Gage [14], с помощью on-line калькулятора, размещенного на сайте www.warfarindosing.org. После подбора индивидуальной дозы варфарина МНО измеряли 1 раз в 3 нед или по необходимости — при развитии эпизодов гипокоагуляций и/или кровотечений. Целевой диапазон МНО для больных с фибрилляцией предсердий и тромбозом глубоких вен составил 2,0—3,0; для больных с искусственными клапанами сердца — 2,5—3,5. Эпизодами чрезмерной гипокоагуляции считали все случаи превышения терапевтического диапазона. Анализировали данные пациентов, полученные в течение 6 мес после начала применения варфарина. Пациенты, участвовавшие в проспективном исследовании, составили основную группу (группа «фармакогенетического» дозирования).
В контрольную группу (группа «традиционного» дозирования) вошли 78 пациентов, участвовавшие в ранее проведенном ретроспективном исследовании, которым варфарин назначали по традиционной схеме, начиная с дозы 5 мг/сут [9]. Анализировали данные пациентов, полученные в течение 6 мес после начала применения варфарина.
МНО в проспективном исследовании определяли в образцах капиллярной крови на приборе CoaguChekXS.
Идентификацию генотипов проводили на амплификаторе Терцик ТП4-ПЦР01 методом полимеразной цепной реакции полиморфизмом длин рестриктивных фрагментов. Геномная ДНК выделена из венозной крови стандартным методом. Праймеры для амплификации подобраны с помощью программы PrimerSelect 4.05©1993—2000 DNASTAR Inc. и синтезированы в российской компании. Размер ампликона составлял 418 п.н. для СYP2С9*2, 102 п.н. для СYP2С9*3 и 406 п.н. для G-1639(3673A. Для идентификации аллеля CYP2C9*2 был использован фермент Bme18I, для аллеля CYP2C9*3 — Bse3DI, для идентификации генотипов полиморфного маркера G-1639(3673A гена VKORC1 — MspI. Все использованные ферменты российского производства. Разделение фрагментов рестрикции проводили с помощью электрофореза в 10% акриламидном геле.
Всем больным назначали варфарин (Никомед, Дания) в начальной дозе, рассчитанной по выбранному алгоритму, затем дозу корректировали по показателям МНО в соответствии с инструкцией по медицинскому применению препарата и его типовой клинико-фармакологической статьей в Государственном реестре лекарственных средств от 2008 г.
7аблиш^-_Сравнительная^арактеристикагрупппациентов
^^^^^^_^^^^^^
|
Генотип |
Наличие эпизодов гипокоагуляции |
Отсутствие эпизодов гипокоагуляции |
р |
|
*1/*1 |
5 |
39 |
|
|
*1/*2 |
3 |
9 |
|
|
*1/*3 |
3 |
17 |
0,021 |
|
*2/*3 |
1 |
0 |
|
|
*2/*2 |
0 |
0 |
|
|
*3/*3 |
1 |
0 |
|
|
7аблица |
3. |
||
|
Генотип |
Эпизоды |
Отсутствие эпизодов |
|
|
гипокоагуляции |
гипокоагуляции |
||
|
GG |
2 |
33 |
|
|
GA |
7 |
25 |
0,024 |
|
AA |
4 |
6 |
|
Анализ результатов выполнен методами непараметрической статистики (двусторонний критерий Фишера, метод Манна— Уитни) с помощью статистических программ Biostat и Instat.
Результаты и обсуждение
Сравнение групп пациентов, изучаемых в исследовании. Согласно данным, приведенным в табл. 1, обе рассматриваемые группы не различались по негенетическим параметрам.
Таблица 1. Сравнительная характеристика групп пациентов.
Примечание. Данные представлены в виде абс. числа больных (%), если не указано другое; нд — недостоверно.
Для оценки риска кровотечений использовали шкалу риска кровотечений при применении варфарина HEMORR2HAGES [14]. Эта шкала, в отличие от других, также применима к генетическим особенностям пациента в отношении генотипа по CYP2C9. Для каждого пациента была рассчитана сумма баллов по шкале HEMORR2HAGES, отражающая риск развития кровотечений при применении варфарина. При этом достоверных различий между группами по риску развития кровотечений в случае применения варфарина, оцененному по шкале HEMORR2HAGES, не наблюдается. Больные были также сопоставимы по показаниям к назначению варфарина. При сопоставлении частот генотипов по локусам CYP2C9 и VKORC1 также обнаружено отсутствие достоверных различий между группами (р=0,178 для CYP2C9и р=0,166 для VKORC1). Таким образом, группы «фармакогенетического» подхода и «традиционного» подхода к дозированию варфарина были сопоставимы как по негенетическим, так и по генетическим параметрам.
Сопоставление частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции при дозировании варфарина методом, основанным на результатах фармакогенетического тестирования, по сравнению с традиционным. Частота развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе «фармакогенетического» дозирования варфарина составляла 17,1% (у 13 пациентов из 76) в то время как в группе «традиционного» подхода к дозированию варфарина она была выше более чем в 3 раза и составляла 56,4% (у 44 пациентов из 78). При проверке с помощью точного двустороннего критерия Фишера оказалось, что обнаруженные различия были статистически значимыми (р=4,1х10-7).
При всей ценности полученного положительного результата наши расчеты выявили некоторые недостатки примененного алгоритма расчета начальной дозы варфарина на основе фармакогенети-ческого тестирования. Как было показано ранее [9], развитие эпизодов чрезмерной гипокоагуляции ассоциировано с генетическим полиморфизмом CYP2C9 и VKORC1. При этом ассоциация полиморфизма гена VKORC1 в общей выборке «замаскирована» полиморфизмом гена CYP2C9 и проявляется только в подгруппе пациентов, не имеющих в генотипе «функционально-дефектных» аллелей гена CYP2C9. В табл. 2 приводятся данные по сопоставлению взаимосвязи между развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции и наличием в генотипе пациента «функционально-дефектных» аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 в группе «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина. Исходя из того что применение фармакогенетического подхода учитывает ассоциацию генетического полиморфизма CYP2C9с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции, можно было ожидать, что его применение нивелирует данную ассоциацию. Однако проверка достоверности наблюдаемых различий между подгруппами пациентов с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции и без таковых с помощью критерия χ2 показала, что различия статистически значимы (р=0,021), т.е. данная ассоциация сохраняется, несмотря на применение фармакогенетического тестирования. Это означает, что алгоритм Gage не в полном объеме исключает влияние генетического полиморфизма CYP2C9 на действие варфарина. Еще более интересный результат мы получили при анализе взаимосвязи генетического полиморфизма VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина (табл. 3): как и в случае CYP2C9, сохраняется ассоциация полиморфизма VKORC1с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции (критерий χ2, р=0,024).
Таблица 2. Взаимосвязь развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с полиморфизмом гена CYP2C9 у больных из группы "фармакогенетического" подхода.
Таблица 3. Взаимосвязь развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с полиморфизмом гена VKORC1 у больных группы «фармакогенетического» подхода.
По нашему мнению, полученные результаты свидетельствуют о том, что использованный фармакогенетический алгоритм Gage в большей степени учитывает эффект «функционально дефектных» аллелей гена CYP2C9, по сравнению с геном VKORC1. Таким образом, обнаруженные нами ассоциации создают предпосылки для совершенствования фармакогенетического алгоритма дозирования варфарина у российских пациентов с высоким риском развития тромбоэмболических осложнений. У подхода, разработанного B.F. Gage и соавт. [14], есть преимущество перед всеми остальными. Создание on-line калькулятора, предлагающего специалистам свободно использовать методику в обмен на информацию о полученных результатах, позволяет вести коррекцию коэффициентов уравнения расчета начальной дозы варфарина [17, 18]. Теоретически, предполагается, что, когда количество пациентов, у которых информация о лекарственном ответе на варфарин будет проанализирована коллективом B.F. Gage, превысит несколько тысяч, можно ожидать достижения более сильной корреляции между расчетной и реальной дозами варфарина. Однако, по нашему мнению, при существующей математической формуле расчета этого не произойдет. В уравнении используется самая простая линейная зависимость — уточнение формулы происходит только за счет изменения коэффициентов. В живых системах линейные модели практически не встречаются. Кроме того, уточнение коэффициентов путем простого добавления большего количества «усредненных» данных приводит к нарушению «истинной» индивидуализации фармакогене- тического подхода к дозированию варфарина. Вероятно, предел точности подобной методологии уже достигнут. Необходимо создание новой математической модели, которая позволит полностью нивелировать взаимосвязь эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с генетическим полиморфизмом CYP2C9 и VKORC1. Это может привести к более значительному повышению безопасности терапии варфарином.
Сопоставление частоты развития кровотечений при дозировании варфарина методом, основанным на результатах фармакогенетического тестирования, по сравнению с традиционным. В группе «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина, из 76 пациентов кровотечения развивались у 3 (4%). В группе «традиционного» подхода к дозированию варфарина, из 78 больных развитие кровотечений наблюдалось у 14 (18%), т.е. в 4,5 раза чаще. Наблюдаемые различия между группами статистически значимы: р=0,009 (оценена с помощью двустороннего критерия Фишера). Полученный результат имеет большую практическую ценность как с точки зрения безопасности для пациента, так и с точки зрения возможной экономии затрат на коррекцию кровотечений. Однако последнее положение нуждается в уточнении, для чего необходимо провести специальный фармакоэкономический анализ. Вместе с тем результаты зарубежных исследований, сравнивающих фармакогенетический подход к дозированию варфарина и традиционный, противоречивы. В части исследований не наблюдалось снижения частоты развития кровотечений при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина [19, 20]. Возможно, это было связано с использованием в исследованиях различных алгоритмов расчета начальной дозы варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования, а также различным «этническим» составом групп пациентов, включенных в исследования.
Из-за малого количества кровотечений, наблюдавшихся в группе «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина, мы не смогли проверить, сохраняется ли ассоциация полиморфизмов генов CYP2C9 и VKORC1 с развитием кровотечений при дозировании варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования.
Следует отметить, что наше исследование имело ряд ограничений:
- Не было рандомизации больных в группах: в качестве группы контроля выступали пациенты из ранее проведенного ретроспективного исследования. Проведение подобной рандомизации технически возможно только в условиях многоцентрового исследования с формированием больших по размеру выборок. Данное исследование отчасти можно расценивать как пилотный проект. В то же время при сравнении групп фармакогенетического подхода к дозированию и традиционного подхода оказалось, что демографические, антропометрические и клинические характеристики в группах достоверно не различались. Кроме того, сравнение в группах частот полиморфизмов генов CYP2C9 и VKORC1 показало, что они статистически значимо не различались, т.е. группы были однородны по генетическим «детерминантам» чувствительности к варфарину. Мы также рассчитали для каждой из групп индекс риска кровотечений при применении варфарина по шкале HEMORRAGES (учитывает генетические особенности), при этом оказалось что средние суммы баллов по этой шкале также статистически значимо не различались между группами, т.е. риск развития кровотечений при применении варфарина у больных в группах был одинаков. Поэтому можно предположить, что снижение частоты кровотечений, полученное в исследовании, было связано именно с применением фармакогенетического подхода к дозированию варфарина.
- Не были в полном объеме сопоставлены особенности подбора дозы (длительность подбора дозы) в группах фармакогенетического подхода к дозированию и традиционного подхода. Это было связано с тем, что доза варфарина больным подбиралась в амбулаторных условиях и длительность подбора дозы зависела не от медицинских причин, а от возможностей пациентов посещать врача для измерения МНО и получения рекомендаций по подбору дозы варфарина.
Заключение
В нашей работе был использован фармакогенетический подход к дозированию варфарина, который заключался в назначении варфарина в начальной дозе, рассчитанной по алгоритму Gage (on-line калькулятор, www.warfarindosing.org). При этом эпизоды чрезмерной гипокоагуляции и кровотечения при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина развивались реже, чем при использовании традиционного метода.
Это было первым российским пилотным исследованием, оценивающим преимущества фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным, которое, однако, имело ряд ограничений. В связи с этим для подтверждения полученных результатов необходимо проведение более крупного многоцентрового рандомизированного исследования, по результатам которого можно будет рекомендовать широкое внедрение фармакогенетического тестирования для персонализации терапии варфарином. Мы показали также, что применение фармакогенетического подхода к дозированию варфарина не устраняет ассоциацию полиморфизмов генов CYP2C9 и VKORC1с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции, а это обусловливает необходимость в совершенствовании фармакогенетического алгоритма Gage. Тем не менее мы полагаем, что фармакогенетический подход к дозированию варфарина с использованием алгоритма Gage уже может применяться в клинической практике у больных с высоким риском кровотечений при использовании пероральных антикоагулянтов.
