Атеросклероз — многофакторное заболевание, в котором дисфункция эндотелия (ДЭ) и воспаление обусловливают прогрессирование друг друга. На ранних стадиях атеросклеротического процесса ДЭ может развиваться в ответ на воздействие воспалительных хемокинов, вырабатываемых мононуклеарами крови (фактор некроза опухоли α, интерферон γ, интерлейкин-1, -2 и др.) [1]. ДЭ сопровождается экспрессией на эндотелиальных клетках молекул адгезии, которые способствуют прилипанию мононуклеаров крови к эндотелиальным клеткам. Адгезированные мононуклеары крови секретируют хемокины, которые вызывают еще бо'льшую дисфункцию эндотелиальных клеток. Таким образом, создается порочный круг, приводящий к ДЭ, а в дальнейшем и к его повреждению.
Насколько сложен процесс адгезии мононуклеаров крови к эндотелию свидетельствует даже простое перечисление некоторых, участвующих в этом процессе рецепторов (интегринов) мононуклеарных клеток (LFA-1, VLA-4, рецептор к фибронектину, рецептор к ламинину, MAC-1, L-селектин, CD31 и др.) [2]. Не менее обширен и перечень участвующих в процессе прилипания и экспрессируемых эндотелием молекул адгезии (Р-селектин, Е-селектин, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-2, VCAM-1, CD-44L, JAM-B, JAM-C, CD31).
Отдельные стороны сложного процесса взаимодействия мононуклеаров крови и эндотелия изучены в эксперименте на животных. В экспериментах in vivo показано, что ДЭ приводит к экспрессии этими клетками Р- и Е-селектинов, что заставляет перемещающиеся в центре потока крови мононуклеары сдвигаться в сторону сосудистой стенки и катиться (перекатываться) по эндотелию (стадии «быстрого и медленного качения»). Если неблагоприятные факторы продолжают действовать на эндотелий, происходит экспрессия эндотелиальными клетками молекул адгезии ICAM-1, ICAM-2, ICAM-2, VCAM-1, CD31 и др.
и наступает стадия прилипания мононуклеаров крови к эндотелию (стадия адгезии клеток крови к эндотелиальным клеткам).
Стадия субэндотелиального проникновения мононуклеаров крови в интиму связана с молекулами адгезии JAM-B, JAM-C, CD-199, CD31 и др. (стадия миграции клеток крови в интиму сосудов) [2, 3].
Мы изучали 3-ю и 4-ю стадии этого процесса (адгезию и проникновение мононуклеаров в субэндотелиальное пространство). Ключевую роль в адгезии к эндотелию и миграции мононуклеаров в субэндотелиальное пространство играет CD31 (или Platelet-endothelial cell adhesion molecule — PECAM, или PECAM-1).
CD31 — это трансмембранный гликопротеин I типа (масса 130 кДа), экспрессирующийся на эндотелиальных клетках.
Эта молекула адгезии экспрессируется на их боковых поверхностях (на границах клеток), поскольку участвует в соединении между собой клеток эндотелия. CD31 экспрессируется и на большинстве клеток крови: моноцитах, нейтрофилах, определенных подтипах лимфоцитов и тромбоцитах [4, 5].
CD31 состоит из вне- и внутриклеточной частей. Внеклеточная часть, непосредственно участвующая в процессе адгезии, состоит из шести иммуноглобулинподобных доменов и непосредственно отвечает за гомофильное соединение (эндотелиальная молекула адгезии CD31 соединяется с такой же молекулой адгезии CD31 на мононуклеаре крови), возникающее в процессе адгезии клеток крови к клеткам эндотелия.
Цель настоящего исследования – изучение экспрессии молекул адгезии эндотелиальными клетками легочной артерии (ЛА) в норме и на разных стадиях атеросклеротического процесса и исследование адгезии мононуклеаров крови к эндотелию ЛА.
Материал и методы
Материалом для исследования служили сегменты ЛА, которые брали во время аутопсий (10 мужчин и 11 женщин), если вскрытие проводилось не позднее 6 ч с момента смерти умершего. Возраст умерших колебался от 55 до 87 лет.
У 6 умерших была ишемическая болезнь сердца (ИБС), у 5 — хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), у 4 — острая пневмония, у 2 — тромбоэмболия, у 2 — порок аортального клапана, у 2 — онкологические заболевания. Исследовали следующие участки: 1) с макроскопически неизмененной интимой; 2) с липидными пятнами; 3) с липидными бляшками. Фиброатеромы, атеросклеротические бляшки с явлениями кальциноза, бляшки с изъязвлениями и бляшки с тромбами не исследовали (табл. 1).
Взятый материал немедленно фиксировали в 4% параформе при рН 7,2—7,4 не менее 20 мин, промывали в фосфатном буфере рН 7,2—7,4, после чего готовили препараты артерий «en face» по ранее описанной методике [6]. Полученные препараты инкубировали с моноклональными антителами к моноцитам и макрофагам (CD68, «DAKO»), Т-лимфоцитам (CD3, CD4, «Beckman Coulter», «Сорбент»), с антителами к ICAM-1, фактору Виллебранда и CD31 антигену (антитела получены от А.В. Мазурова РКНПК МЗ РФ) [7]. Реакцию визуализировали с помощью иммунопероксидазной реакции или метки щелочной фосфатазой. Иммуногистохимическую реакцию (ИГХР) проводили в иммуностейнере Ventana. Отдельные ИГХР проводили без иммуностейнера по общепринятой методике.
После ИГХР препараты окрашивали гематоксилином, метиловым зеленым или окрашивали на жир красителем Oil red.
Площадь повреждений (микроэрозий) в эндотелиальном покрове сосудов измеряли с помощью прибора Scanscope.
На определенной измеренной ранее площади препарата измеряли суммарную площадь всех эрозий. Затем площадь препарата делили на суммарную площадь находящихся на ней микроэрозий, т.е. получали коэффициент повреждения эндотелия на этой площади. С целью уточнения полученных данных отдельно высчитывали коэффициент повреждения для микроэрозий площадью менее 700 мкм2 и отдельно для эрозий площадью более 700 мкм2
Статистический анализ данных проводили с применением программы Statistica 6.0. Для оценки достоверности различий количественных показателей использовали непараметрические критерии Манна—Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты
В участках без атеросклеротических изменений эндотелий, выстилающий ЛА, имел полигональную форму, размеры клеток колебались в широких пределах (рисунок а, см. цв. вклейку). ИГХР с антителами к антигену CD31 обнаружила этот антиген на поверхности мембраны клеток, в области их контакта с окружающими эндотелиальными клетками. Отдельные эндотелиальные клетки были полностью окрашены, так как антиген CD31 экспрессировался всей поверхностью цитоплазматической мембраны (рисунок а, см. цв. вклейку). Встречались эндотелиальные клетки, отдельные участки мембраны которых были лишены антигена CD31, в то же время клетка анатомически была целой. В препаратах «en face» обнаруживали микроэрозии площадью от одной до нескольких эндотелиальных клеток. Края микроэрозии имели «зубчики», направленные к центру эрозии и представляющие собой фрагменты цитоплазмы разрушенной ранее эндотелиальной клетки. Дно микроэрозии было представлено адгезированными на базальной мембране тромбоцитами и мононуклеарами крови (рисунок б, см. цв. вклейку). Кроме микроэрозий площадью менее 700 мкм2 имелись эрозии, площадь которых превышала 700 мкм2. На поверхности эндотелия встречали единичные Т-клетки CD4 и CD8.
В препаратах «en face» ЛА с липидными пятнами и липидными полосками эндотелиальные клетки имели полигональную форму, их размеры колебались в широких пределах. В отдельных клетках ИГХР обнаружила антиген CD31 не только на границах эндотелиальных клеток, но и на поверхности всей мембраны, обращенной в просвет сосуда. Концентрация этого антигена на одних клетках была выше, на других — ниже. Часто это были соседние клетки. ИГХР с антителами к CD31 у единичных эндотелиальных клеток выявила неоднородность окраски их границ. На границах отдельных клеток местами и очень локально CD31 отсутствовал, т.е. граница клетки в каком-то месте выглядела как бы разорванной, оставаясь анатомически целой. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) эндотелиальных клеток с помощью антител к антигену CD31 помимо отдельных пограничных участков цитоплазматической мембраны, лишенных этого белка, обнаружило микроэрозии в эндотелиальном покрове, места, на которых отсутствовала одна или несколько эндотелиальных клеток.
На поверхности эндотелия и субэндотелиально встречались единичные клетки и небольшие кластеры Т-клеток CD4 и CD8. Единичные клетки CD68 и их кластеры были адгезированы на эндотелии и обнаруживались в интиме артерий. Кластеры клеток CD68 в интиме сосуда четко соответствовали липидным пятнам в сосуде. Группы адгезированных на эндотелии Т-клеток содержались как в зоне с липидными отложениями, так и в интактных (макроскопически) участках. На поверхности эндотелиальных клеток обнаруживали молекулы адгезии ICAM-1 и VCAM-1. Эти антигены гомогенно распределялись по всей поверхности эндотелиальных клеток. Клетки эндотелия интенсивно окрашивались при ИГХР с антителами к фактору Виллебранда.
Среди исследованных нами образцов ЛА с липидными бляшками обнаружены как единичные клетки, так и кластеры адгезированных Т-клеток (CD4, СD8) и моноцитов (CD68).
Большие группы этих клеток можно было видеть субэндотелиально. Цитоплазма макрофагов часто была перегружена липидами, которые в виде капель встречались в интиме и вне клеток. Макроскопически липидные атеросклеротические бляшки были без эрозий и изъязвлений, но у отдельных больных при реакции с антителами к антигену CD31 и фактору Виллебранда обнаружены повреждения эндотелия. Дефекты в эндотелиальном покрове артерии по площади были равны одной или нескольким клеткам. Чаще такие дефекты (в препаратах «en face») встречались непосредственно над липидными бляшками. В области дна таких дефектов эндотелия находились адгезированные мононуклеары крови и тромбоциты. Тромбоциты, находящиеся на дне таких микроэрозий, давали интенсивную иммунопероксидазную реакцию с антителами к антигену CD31.
Число и площадь микроэрозий увеличивались в образцах ЛА, в которых имелись липидные пятна и липидные бляшки, однако эти изменения были недостоверными. Такой результат, возможно, связан с недостаточным количеством измерений в этих двух группах. Обнаружены достоверные различия между суммарной площадью больших (площадью более 700 мкм2) и малых (площадью менее 700 мкм2) эрозий у умерших с ХОБЛ (p<0,05) (табл. 2).
Эти данные могут свидетельствовать о кластерных повреждениях эндотелия у больных ХОБЛ. Очевидно, при этой патологии повреждаются целые кластеры (группы) эндотелиальных клеток, разбросанные по интимальной поверхности сосуда. У умерших больных ИБС различия между микроэрозиями площадью более 700 мкм2 и менее 700 мкм2 были недостоверными, т.е. повреждение эндотелия было связано как с единичными эндотелиальными клетками, так и с целыми кластерами эндотелиальных клеток (табл. 3).
Суммарная площадь повреждения эндотелия у умерших больных ИБС не отличалась от площади повреждения эндотелия у больных ХОБЛ (p>0,05). Отсутствие такой разницы может быть связано с недостаточным количеством исследований в группе умерших больных ИБС.
Обсуждение
В атеросклеротических бляшках содержатся и Т-клетки CD4 и Т-клетки CD8. Одни исследователи склоняются к тому, что в атеросклеротических бляшках доминируют Т-клетки CD4 [8], другие считают, что число их примерно одинаково или даже Т-клеток CD8 больше [9, 10]. Согласно нашим данным, соотношение адгезированных к эндотелию Т-клеток CD4 и CD8 было примерно равным, а в единичных случаях Т-клетки CD8 даже доминировали. Мы считаем, что обнаруженные на эндотелии Т-клетки принимают участие в патогенезе атеросклероза.
Есть данные о том, что Т-клетки CD8 препятствуют развитию гиперплазии интимы и прогрессированию атеросклероза [11, 12].
Обнаружено, что Т-хелперы регуляторные (субпопуляция Т-клеток CD4) при пересадке мышам с атеросклерозом ослабляют и замедляют его течение, другая субпопуляция – Т-хелперы эффекторные, ускоряет течение атеросклеротического процесса [13], т.е. теоретически появляется возможность воздействовать (с помощью пересадки субпопуляций Т-клеток больному) на атеросклеротический процесс. Есть мнение, что на самых ранних стадиях атеросклеротического процесса Т-клетки первыми реагируют на эту патологию и первыми внедряются в интиму артерий, еще до появления макрофагов и до отложения в интиме липидов [14]. Выявление нами адгезированных на макроскопически нормальном эндотелии Т-клеток позволяет предполагать их раннюю реакцию на ДЭ, развивающуюся еще до видимых атеросклеротических изменений. Макрофаги и адгезированные на эндотелии моноциты (клетки CD68) обнаружены уже на стадии липидных пятен и количество их возрастает одновременно с прогрессированием атеросклеротического процесса. Все перечисленное свидетельствует о непосредственном участии этих клеток в развитии данного патологического процесса. Следует отметить, что популяция клеток CD68 неоднородна. Выделяют макрофаги М-1 провоспалительные, макрофаги М-2 (M2a, M2b, M2c), ослабляющие течение воспаления, и гемоглобин-ассоциированные макрофаги (M[Hb] макрофаги) [15, 16]. Разные субпопуляции макрофагов могут по-разному воздействовать на атеросклеротический процесс, ускоряя или замедляя его.
Молекулы адгезии ICAM-1 и VCAM-1 обычно не «подчеркивали» границы эндотелиальных клеток (как было с антителами к CD31 — PECAM-1), а экспрессировались на всей поверхности наружной мембраны эндотелиальной клетки.
Результаты работы подтвердили отмеченную ранее другими исследователями гетерогенность эндотелия [7]. В крупных ветвях ЛА обнаружена мозаичность экспрессии антигена CD31.
Одни эндотелиальные клетки были с высокой экспрессией этого антигена, а другие клетки не экспрессировали его или экспрессировали в крайне низкой концентрации. Проявлением гетерогенности служит неоднородность экспрессии CD31 в пределах одной эндотелиальной клетки: встречаются эндотелиальные клетки, у которых антиген CD31 мембраны на протяжении какого-нибудь сегмента локально отсутствует.
При этом клетка демонстрирует анатомическую целостность. Такие клетки мы встречали, главным образом, в артериях с липидными пятнами и атеромами.
Похожие локальные потери антигена CD31 мембраной эндотелиальной клетки обнаружены при радиоактивном облучении культуры пупочного эндотелия и культуры эндотелия капилляров мозга [17]. P. Sharma и соавт. (2013) облучали культуру пупочного эндотелия и культуру капилляров мозга и через 3 ч после этого исследовали эндотелиальные клетки в них. Оказалось, что единичные клетки на протяжении какого-нибудь отрезка «боковой» мембраны теряют антиген СD31 [17].
Сравнительное аутопсийное исследование ЛА у умерших больных обнаружило полигональную форму эндотелия с четкой экспрессией CD31 антигена на «боковой» поверхности клетки. Дисфункция клетки эндотелия приводит к потере антигена CD31 эндотелиальной клеткой. Потеря клеткой антигена CD31 сопровождается ослаблением связи между клетками и приводит к «выпадению» такой клетки из эндотелиального пласта. Таким образом, в эндотелии, выстилающем ЛА, образуются микроэрозии (бреши, микроочаги деструкции) [17, 18].
Эксперименты P. Sharma и соавт. с микросферами подтвердили то, что такие изменения эндотелия возможны и in vivo [17].
Можно считать, что эндотелий стереотипно реагирует на разные негативные воздействия, как на облучение и температуру в культуре эндотелиальных клеток, так и на те, которые возникают в живом организме и приводят к атеросклерозу. В этой работе показано локальное исчезновение CD31 из мембран отдельных эндотелиальных клеток и наличие разных по площади дефектов в эндотелиальном покрове. Количество таких дефектов (микроэрозий, брешей, микроочагов деструкции) увеличивалось при прогрессировании атеросклероза, но разница была недостоверной. Возможно, это связано с недостаточным количеством материала в группах. В группе больных ХОБЛ обнаружены достоверные различия между суммарной площадью микроэрозий площадью более 700 мкм2 по сравнению с микроэрозиями площадью менее 700 мкм2. Выявленные различия свидетельствуют о том, что повреждение эндотелия при этой патологии возникает не точечно, а на площади, т.е. поражаются целые кластеры клеток. Кластерное повреждение клеток эндотелия может быть связано с повышенным давлением в системе ЛА, которое нередко сопровождает такое заболевание, как ХОБЛ. Повышенное давление в ЛА приводит к повреждению эндотелия и может сопровождаться развитием микроэрозий. Нам не удалось выявить достоверных различий по площади повреждения эндотелия у умерших больных ИБС по сравнению с больными ХОБЛ. Возможно, это связано с недостаточным количеством исследованного материала в группах.
С помощью культуры эндотелия было показано, что через 6 ч после негативного воздействия на нее эндотелиальные клетки полностью закрыли образовавшиеся ранее дефекты (микроэрозии, бреши) и стали неотличимы от контроля [17]. Это позволяет надеяться на преходящий характер таких повреждений (повреждений, равных по площади одной эндотелиальной клетке).
Таким образом, при микроскопическом исследовании препаратов «en face» на поверхности макроскопически нормального эндотелия иногда обнаруживаются дефекты в эндотелиальном покрове с тромбоцитарными агрегатами, свидетельствующие о прижизненном его повреждении. Можно предположить, что в данном случае мы имеем дело с самыми начальными изменениями. Возможно, одни дефекты в эндотелиальном покрове могут увеличиваться в размерах, дно их может изъязвляться, что приведет к тромбозу, а другие снова могут покрыться эндотелием.
Заключение
Обнаружена гетерогенность эндотелиальных клеток в зависимости от их места нахождения и их состояния. Эндотелиальные клетки в интактных к атеросклерозу легочных артериях имели полигональную или вытянутую форму.
У больных хронической обструктивной болезнью легких выявлены достоверные различия в повреждениях эндотелиальных клеток легочной артерии. Повреждение эндотелия при этой патологии носит очаговый, мозаичный и кластерный характер, т.е. локально повреждаются сразу несколько эндотелиальных клеток, что приводит к образованию «большой» микроэрозии.
