Более 50 лет тому назад D. Harman в США была высказана революционная идея о том, что свободнорадикальные реакции, вызывая повреждения клеточных структур, могут участвовать в механизме старения организма [1]. Практически одновременно F. Bernheim [2] обосновал представление о природных антиоксидантах как регуляторах свободнорадикальных реакций в тканях, а Н.М. Эмануэль* [3] высказал гипотезу о том, что свободные радикалы могут провоцировать возникновение и развитие различных патологических состояний. Эти работы заложили краеугольные камни в фундамент новой научной дисциплины — свободнорадикальной биологии и медицины. Первоначальные представления о неферментативной природе свободнорадикальных процессов в организме, в регуляции которых участвуют низкомолекулярные фенольные антиоксиданты — «ловушки радикалов» (подобные α-токоферолу, восстановленной форме коэнзима Q и полифенолам растительного происхождения), позднее были дополнены открытием ферментативных реакций, субстратами которых являются свободные радикалы или лабильные продукты свободнорадикального окисления (СРО). В частности, благодаря исследованиям I. Fridovich [4] было установлено, что хорошо известный голубой белок эритроцитов эритрокупреин способен катализировать дисмутацию супероксидных анион-радикалов, т.е. является супероксиддисмутазой (СОД). В работах B. Christophersen было установлено, что глутатионпероксидаза обладает широкой субстратной специфичностью и способна восстанавливать не только пероксид водорода, но и разнообразные органические гидропероксиды, включая гидроперокси-производные полиненасыщенных жирных кислот [5]. Позднее мы показали, что некоторые изозимы глутатион-S-трансферазы могут восстанавливать не только гидропероксиды полиеновых жирных кислот, но и гидроперокси-производные мембранных фосфолипидов [6].
Таким образом, стало очевидно, что регуляция СРО в организме осуществляется хорошо сбалансированной системой, включающей как неферментативные реакции с участием низкомолекулярных «ловушек радикалов», так и процессы с участием ферментов, утилизирующих активные формы кислорода — АФК (О2·–,НО2·, НО· и Н2О2) или предотвращающих их образование, а также с участием ферментов, восстанавливающих лабильные продукты СРО (такие как липогидропероксиды), которые способны к гомолизу с образованием активных вторичных органических радикалов (типа акоксильных радикалов RО·) [7].
Мы впервые предложили называть эти ферменты (СОД, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатион-S-трансфераза) антиоксидантными ферментами [8], причем в настоящее время эта терминология широко используется в мировой научной литературе. Следует отметить, что к антиоксидантным ферментам необходимо также отнести сравнительно недавно открытые пероксиредоксины, способные подобно глутатионпероксидазе восстанавливать и пероксид водорода, и различные органические гидропероксиды [9]. Несмотря на то что с момента первых публикаций D. Harman и Н.М. Эмануэля прошло немало времени, их гипотезы не утратили своего значения и получили многочисленные экспериментальные подтверждения.
О наличии первичных продуктов СРО липидов — липопероксидов в атеросклеротических бляшках аорты человека — впервые было сообщено J. Glavind и соавт. в 1952 г. [10]. Следует отметить, что существенным недостатком этой работы было использование неспецифичного метода определения липопероксидов. Несмотя на это на протяжении многих лет статья J. Glavind и соавт. активно цитировалась в качестве экспериментального подтверждения возможного участия свободных радикалов в процессах атеросклеротического повреждения стенки сосудов. Однако спустя более 10 лет выводы статьи J. Glavind и соавт. были подвергнуты сомнению группой авторов из лаборатории К. Oette, разработавших чувствительный и высокоспецифичный метод йодометрического титрования с амперометрической регистрацией точки эквивалентности для определения концентрации гидропероксидов в липидных экстрактах тканей [11]. В этой работе при анализе аутопсийного материала с использованием специфичного метода определения не было обнаружено достоверных отличий в содержании липопероксидов в непораженных зонах аорты человека и липофиброзных бляшках. К сожалению, в этой, как и в предыдущей работе, было изучено небольшое количество аутопсий, причем не было указано время забора материала после наступления смерти, что является чрезвычайно важным ввиду возможности как дополнительного посмертного образования липопероксидов, так и посмертной деструкции этих весьма лабильных соединений. Вследствие этого нами было предпринято уникальное исследование, в котором забор аутопсийного материала после несчастных случаев с летальным исходом осуществлялся в интервале 1—3 ч после наступления смерти (в рамках специальной программы по исследованию атеросклероза, осуществлявшейся в бывшем Советском Союзе в 1977—1982 гг.). При использовании специфичного метода жидкостной хроматографии высокого разрешения мы установили, что содержание липопероксидов (преимущественно 13-гидропероксилинолеата) по сравнению с непораженными зонами стенки сосуда (интима+медиа) достоверно увеличено в области липидных пятен и в еще большей степени в области фиброзных бляшек (проанализировано более 20 аутопсий) [12]. Анализ липопероксидов, выделенных из различных зон атеросклеротических повреждений, при жидкостной хроматографии высокого разрешения на колонке с хиральной фазой позволил идентифицировать практически равное соотношение стериоизомеров R и S 13-гидроперокси-производных линолеата, что свидетельствует о неферментативном происхождении окисленных липидов в стенке сосудов при атеросклерозе [12]. Кроме того, при исследовании этого же материала нами было показано достоверное снижение активности ключевых антиоксидантных ферментов (СОД и глутатионпероксидазы) в липидных пятнах и в еще большей степени в фиброзных бляшках по сравнению с непораженными зонами аорты [12]. Очевидно, что увеличение образования продуктов СРО в тканях при одновременном снижении активности систем утилизации этих продуктов можно рассматривать в качестве проявлений окислительного стресса [7].
В крови больных атеросклерозом, выявленных при эпидемиологическом обследовании населения Москвы в рамках проводившегося в 1976—1980 гг. российско-американского сотрудничества, мы обнаружили достоверное увеличение уровня первичных и вторичных продуктов СРО липидов при одновременном достоверном снижении активности эритроцитарной глутатионпероксидазы [12]. Весьма важно, что контрольную группу в этом исследовании составляли лица из репрезентативной выборки, полученной в рамках проводимого эпидемиологического обследования [12].
В соответствии с нашими данными [12] активность антиоксидантных ферментов (СОД и глутатионпероксидазы) в цитозоле печени кроликов и мини-свиней с алиментарной гиперхолестеринемией была значительно снижена, тогда как содержание липопероксидов в микросомах печени этих же животных было существенно увеличено. Одновременно в печени исследованных животных наблюдали значительное снижение активности микросомальной 7α-гидроксилазы холестерина (ХС) — ключевого фермента катаболизма ХС [12]. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что гиперхолестеринемия, способствуя снижению активности антиоксидантных ферментов в печени, является пусковым фактором СРО мембранных фосфолипидов, сопровождающегося подавлением мембранносвязанных ферментных систем, ответственных за регуляцию уровня этого стерина по механизму обратной связи. Увеличение ригидности мембран при повышении в них содержания ХС, по крайней мере, частично может быть компенсировано запуском СРО мембранных фосфолипидов, поскольку накопление липогидропероксидов и в еще большей степени продуктов их восстановления глутатионпероксидазой способствует увеличению жидкостности мембраны [13]. Алкоксильные и гидропероксидные радикалы, образующиеся при СРО полиеновых фосфолипидов в липидно-белковых комплексах, могут инициировать соокисление ХС с образованием ряда цитотоксичных продуктов, включая 7α-гидропероксихолестерин и 7α-гидроксихолестерин, холестантриол и т.д. [12]. Данные наших экспериментов на кроликах показывают, что оксистерины оказывают значительно более выраженное атерогенное действие, чем неокисленный ХС [14]. Совокупность полученных данных привела нас к заключению, что атеросклероз является «свободнорадикальной патологией», т.е. заболеванием, в этиологии и патогенезе которого важную роль играют процессы СРО [15].
Формирование липидных отложений в магистральных артериях при атеросклерозе связывают с нерегулируемым захватом богатых ХС липопротеидов низкой плотности (ЛНП) клетками стенки сосудов (преимущественно макрофагами моноцитарного происхождения), после чего они превращаются в перегруженные липидами «пенистые клетки» и образуют зону липоидоза — первичное предатерогенное повреждение стенки сосуда [12]. В работах лауреатов Нобелевской премии M.S. Goldstein и J.L. Brown показано, что химически модифицированные частицы ЛНП — ацетилированные ЛНП — захватываются макрофагами более эффективно, чем нативные частицы ЛНП, поскольку этот процесс осуществляется с участием особых скевенджер-рецепторов [16]. Интенсификация перекисного окисления липидов способствует увеличению в плазме крови уровня природного дикарбонила — малонового диальдегида (МДА), который является вторичным продуктом СРО полиеновых липидов и образуется при окислительной деструкции первичных продуктов окисления — липогидропероксидов [12]. Показано, что частицы ЛНП, модифицированные МДА, поглощаются культивируемыми макрофагами человека более эффективно, чем нативные ЛНП [17]. Окисленные ЛНП являются более атерогенными (более интенсивно захватываются макрофагами), чем неокисленные ЛНП [18]. Степень окисленности частиц ЛНП и, соответственно, соотношение первичных и вторичных продуктов СРО в них могут определять различия в биологических эффектах ЛНП, включая эффективность их поглощения макрофагами, способность вызывать апоптоз этих клеток, экспрессию молекул адгезии в эндотелиальных клетках и т.п. [19, 20]. В связи с этим отдельные авторы для обозначения степени окисленности ЛНП предлагают такие термины, как «минимально окисленные» ЛНП или «экстенсивно окисленные» ЛНП [19, 20]. Тем не менее в цитированных работах степень окисленности ЛНП оценивали достаточно произвольно, без установления четких количественных критериев, что возможно лишь на основании исследования содержания первичных и вторичных продуктов СРО. При индукции СРО ЛНП in vitro ионами металлов переменной валентности (что имитирует процессы, происходящие in vivo) сначала образуются первичные продукты окисления — липогидроперокси-производные полиеновых ацилов фосфатидилхолинов наружного фосфолипидного слоя частиц ЛНП [12]. Тем не менее ионы металлов одновременно катализируют окислительную деструкцию органических гидропероксидов, сопровождающуюся образованием вторичных продуктов — различных a,b-ненасыщенных оксоальдегидов (таких как 4-гидроксиноненаль и 4,5-дигидроксидеценаль) и в конечном итоге МДА [12]. Процессы сопряженного накопления первичных и вторичных продуктов неизбежно происходят и при любых других способах окисления ЛНП в условиях in vitro и ex vivo — при индукции окисления азо-инициаторами, гипогалоидами, пероксидом водорода или органическими гидропероксидами (такими как трет-бутила гидропероксид), гемом или гемопротеид-содержащими (гемоглобин, пероксидаза хрена, цитохром Р450) системами, а также при инкубации ЛНП в присутствии клеток различных типов (полиморфноядерные нейтрофилы, эндотелиоциты и др.), генерирующих супероксидные анион-радикалы и другие АФК. Очевидно, что аналогичные реакции протекают и in vivo, вследствие чего в кровотоке циркулируют ЛНП различной степени окисленности с разным соотношением первичных и вторичных продуктов окисления, что сильно усложняет оценку роли отдельных продуктов окисления в увеличении атерогенности ЛНП (т.е. увеличения захвата этих частиц клетками стенки сосудов).
Изменение конформации единственного белка ЛНП — апопротеина В-100 — принципиально может происходить вследствие изменения микровязкости его липидного окружения при накоплении полярных ацилгидропероксидов в процессе свободнорадикального перекисного окисления фосфатидилхолинов наружного слоя частиц ЛНП, как это было продемонстрировано нами при окислении ЛНП и липосом [21]. Кроме того, конформация апоВ-100 может изменяться при химическом взаимодействии альдегидных групп природных дикарбонилов (преимущественно МДА) с e-аминогруппами лизиновых остатков молекул этого апопротеина, что сопровождается образованием внутри- и межмолекулярных сшивок (cross links) типа шиффовых оснований [12]. Таким образом, как пространственная ориентация белковой молекулы апоВ, так и/или рецепторные и антигенные свойства белка в зависимости от преобладания первичных либо вторичных продуктов в частицах ЛНП могут претерпевать значительные изменения. В соответствии с этим, с нашей точки зрения, следует различать собственно окисленные (ацилгидропероксидсодержащие) ЛНП и ЛНП, модифицированные природными дикарбонилами. Тем не менее разделить «окисленные» и «модифицированные» ЛНП при использовании имеющихся модельных систем СРО ЛНП невозможно, поскольку в процессе окисления ЛНП в модельных системах накопление и первичных, и вторичных продуктов окисления липидов происходит практически одновременно (см. выше).
Существует единственный корректный способ получения собственно «окисленных» (обогащенных ацилгидроперокси-производными фосфатидилхолинов) ЛНП, без существенной примеси вторичных продуктов, основанный на использовании С-15 животной липоксигеназы [12], который был разработан нами для контролируемого окисления биомембран in vitro [22]. С-15 животная липоксигеназа может непосредственно окислять полиеновые ацилы в молекулах фосфолипидов и эфиров ХС без их предварительного гидролиза при физиологических значениях рН, в отличие от С-15 растительной липоксигеназы, способной окислять исключительно свободные полиеновые жирные кислоты в сильно щелочной среде [12]. При окислении свободной арахидоновой кислоты С-15 растительной липоксигеназой (липоксигеназа соевых бобов) образуется 15-гидропероксиарахидонат, а при окислении арахидонат-содержащего фосфатидилхолина или холестериларахидоната С-15 животной липоксигеназой (липоксигеназа ретикулоцитов кролика) образуются соответствующие 15-гидропероксиацил-производные арахидоната [23]. Нами и другими авторами показано, что ЛНП плазмы крови человека являются хорошим субстратом для окисления С-15 животной липоксигеназой [24, 25], причем при ассоциации с частицами ЛНП происходят конформационные изменения молекулы фермента, что сопровождается активацией липоксигеназы и увеличением эффективности ферментативного окисления ЛНП [24]. Исходя из этого, мы использовали возможность корректного получения из одного и того же образца плазмы крови человека как «окисленных» ЛНП (ЛНП, обогащенных гидроперокси-производными фосфолипидов) при помощи их мягкого ферментативного окисления С-15 животной липоксигеназой, так и «модифицированных» ЛНП при помощи химической реакции с природным дикарбонилом МДА [26]. Такой подход позволил провести селективное исследование биологического действия ЛНП, модифицированных либо первичными, либо вторичными продуктами СРО липидов [26]. Результаты экспериментов однозначно показали, что «окисленные» (обогащенные липогидропероксидами) частицы ЛНП поглощаются культивируемыми макрофагами человека с той же эффективностью, что и нативные (неокисленные) ЛНП, тогда как ЛНП, модифицированные МДА, весьма активно захватываются макрофагами [26]. Следовательно, атерогенными являются не «окисленные» ЛНП, а карбонил-модифицированные ЛНП.
Содержание МДА в крови больных атеросклерозом значительно увеличено [12, 27], причем при исследовании уровня МДА-модифицированных ЛНП (иммунохимическим методом с помощью тест-наборов фирмы Mercodia, Швеция) в двух независимых репрезентативных выборках населения Москвы (Россия) и Таллина (Эстония) мы установили, что существует хорошая корреляция (r=0,6; p<0,05) между уровнем ХС в ЛНП и содержанием МДА-модифицированных частиц ЛНП [28]. Исходя из этих данных, можно утверждать, что наиболее атерогенные (содержащие наиболее высокие уровни ХС) ЛНП одновременно являются и наиболее подвергшимися СРО. Исходя из этого можно предположить, что именно карбонил-модифицированные ЛНП способствуют быстрому накоплению ХС в стенке сосудов, поскольку этот процесс осуществляется при помощи скевенджер-рецепторов. Следовательно, атерогенность ЛНП может определяться не только (а вероятно, и не столько) уровнем ХС в них, но и степенью окисленности частиц ЛНП.
Действительно, содержание липогидропероксидов в ЛНП больных атеросклерозом без гиперхолестеринемии более чем в 4 раза выше, чем у практически здоровых лиц того же возраста, а у больных с гиперхолестеринемией — более чем в 8 раз выше, чем в контроле [27]. Показательно, что содержание гидропероксифосфолипидов в ЛНП у больных сахарным диабетом (СД) 2-го типа с выраженными нарушениями углеводного обмена (гликированный гемоглобин 8,1±0,03%), как установлено нами [27], было экстремально высоким и превышало значения этого показателя по сравнению с контролем почти в 25 раз, а по сравнению с таковым у больных атеросклерозом с гиперхолестеринемией — более чем в 3 раза.
Давно известно, что СД является фактором риска возникновения и развития атеросклероза, причем наличие сопутствующего СД значительно ускоряет прогрессирование атеросклероза [29]. Более того, не менее 70% больных СД умирают от сердечно-сосудистых осложнений [29]. В доступной литературе нам не удалось найти исчерпывающего объяснения этим хорошо известным фактам. Тем не менее на определенные размышления наводит то, что при диабетической гипергликемии наблюдается процесс автоокисления глюкозы, при котором усилено образование гомолога МДА — двууглеродного дикарбонила глиоксаля [30]. При фрагментации триозофосфатов, накапливающихся при СД вследствие активации гликолиза, происходит увеличение содержания другого дикарбонила — метилглиоксаля [27, 30], который является изомером МДА. Поскольку МДА может вызывать атерогенную модификацию ЛНП и МДА-модифицированные ЛНП способны интенсивно захватываться имеющими скевенджер-рецепторы макрофагами [17, 27], нам представлялось вполне оправданным исследовать атерогенные потенции глиоксаля, обладающего большим структурным сходством с МДА. В результате экспериментов, проведенных двумя независимыми методами (по накоплению в клетках ХС ЛНП или флуоресцентно-меченых ЛНП), было установлено, что глиоксаль-модифицированные ЛНП поглощаются культивируемыми макрофагами даже более эффективно, чем МДА-модифицированные [27]. Кроме того, глиоксаль-модифицированные ЛНП значительно быстрее, чем МДА-модифицированные ЛНП, элиминировались из кровотока при их введении экспериментальным животным [27].
Глюкоза может подвергаться автоокислению, причем при соокислении с полиеновыми липидами эта гексоза под действием липидных радикалов способна фрагментироваться с образованием глиоксаля [31]. Внесение глюкозы в среду инкубации при индуцированном окислении ЛНП или фосфолипидных липосом вызывает интенсификацию СРО липидов. Причем нами установлено, что в процессе соокисления липидов и глюкозы происходит генерирование супероксидного анион-радикала, поскольку добавление СОД в систему окисления резко подавляет процесс липопероксидации [32]. Кроме того, как показано нами, взаимодействие образующегося при окислении глюкозы дикарбонила метилглиоксаля с концевой аминокислотой апопротеина ЛНП (апоВ-100) — L-лизином также сопровождается генерированием супероксидного радикала (подтверждено двумя независимыми методами: по восстановлению синего нитротетразолия и по интенсификации хемилюминесценции при контрольном добавлении СОД) [27, 33]. Таким образом, при диабетической гипергликемии создаются дополнительные возможности для образования АФК и интенсификации СРО ЛНП с их последующей атерогенной карбонильной модификацией.
Проведенные нами исследования показали, что эффективная сахароснижающая терапия больных СД 2-го типа с выраженными нарушениями углеводного обмена, приводящая к нормализации уровня гликированного гемоглобина, сопровождается одновременным значительным снижением повышенных до терапии уровней МДА и гидроперокси-ЛНП в плазме крови [32]. Таким образом, только подавление гипергликемиии дает псевдоантиоксидантный эффект (ингибирование СРО без использования антиоксидантных препаратов). Широко применяемое при СД лекарственное средство метформин, помимо сахароснижающего действия, должно обладать, как все вещества из класса гидразинов, способностью связывать природные дикарбонилы. Экспериментально доказано, что метформин при лечении больных СД активно реагирует с метилглиоксалем, образуя циклическое производное — триазепинон, которое интенсивно экскретируется с мочой, и может быть идентифицировано с помощью масс-спектрометрии [34]. Одновременно установлено, что терапия метформином действительно приводит к существенному снижению уровня метилглиоксаля в крови больных СД [34]. В соответствии с этими данными в нашем исследовании было показано, что метформин значительно более эффективно снижает уровни МДА и гидроперокси-ЛНП в плазме крови больных СД (в 2,5 и 5 раз соответственно), чем другое сахароснижающее средство из класса производных сульфанилмочевины, которое не обладает способностью утилизировать дикарбонилы [32]. Такое резкое различие по псевдоантиоксидантному действию метформина и производных сульфанилмочевины не может быть объяснено различиями по сахароснижающему действиу этих препаратов, поскольку уровень гликированного гемоглобина в двух группах по окончании терапии достоверно не различался [32]. Таким образом, можно предположить, что метформин подавляет радикалообразование в крови больных СД (за счет снижения уровня АФК, которые могут образоваться при взаимодействии метилглиоксаля с аминогруппами белков) и тем самым способен подавлять дальнейшее развитие окислительного стресса [33].
Одним из факторов, провоцирующих окислительный стресс при СД, вероятно, является сниженный уровень активности антиоксидантных ферментов в крови больных [35, 36]. В нашем исследовании у больных СД 2-го типа в крови выявлено резкое снижение активности СОД и глутатионпероксидазы [36], причем при выраженном нарушении углеводного обмена активность СОД уменьшалась в 2,6 раза по сравнению с таковой у практически здоровых людей того же возраста [36]. Можно предположить, что отмеченное многими авторами накопление α-оксоальдегидов, в частности глиоксаля и метилглиоксаля, в крови больных при СД [37] приводит к развитию так называемого карбонильного стресса [27, 32]. Низкомолекулярные альдегиды, способные модифицировать белковую часть ЛНП, вероятно, могут легко проникать через эритроцитарную мембрану и многократно увеличивать уровни химически агрессивных дикарбонилов — глиоксаля и метилглиоксаля в красных кровяных клетках больных СД, что должно, приводить к химической модификации и других протеинов кровотока, таких как эритроцитарные антиоксидантные ферменты. Нами установлено, что природные α-оксоальдегиды действительно способны подавлять активность гомогенных препаратов антиоксидантных ферментов — СОД и глутатионпероксидазы, причем ингибирующее действие глиоксаля и метилглиоксаля было более выражено, чем ингибирующее действие МДА [36]. На основании исследования изменения кинетических параметров ферментов при действии исследованных дикарбонилов можно полагать, что подавление активности ферментов связано с конформационными изменениями в активном центре их молекул [36]. Инкубация эритроцитов человека в присутствии природных α-оксоальдегидов также сопровождалась ингибированием активности внутриклеточных СОД и глутатионпероксидазы, которое при добавлении в среду инкубации глиоксаля и метилглиоксаля было существенно большим, чем МДА [36]. Эти результаты подтверждают способность быстрого проникновения низкомолекулярных дикарбонилов через достаточно ригидную мембрану эритроцитов, что свидетельствует о возможности реализации ингибирующего действия этих соединений в условиях карбонильного стресса при СД in vivo.
Нормализация уровня гликированного гемоглобина у больных СД 2-го типа при терапии сахароснижающими препаратами в наших исследованиях сопровождалась существенным увеличением активности СОД, причем активность этого фермента возрастала в значительно большей степени при терапии метформином (в 2,6 раза) по сравнению с терапией производными сульфанилмочевины (в 1,4 раза) [36]. Можно полагать, что увеличение активности эритроцитарной СОД в крови больных СД в процессе эффективной сахароснижающей терапии непосредственно связано с уменьшением проявлений карбонильного стресса при купировании нарушений углеводного обмена у пациентов, причем большее увеличение активности СОД при терапии метформином, вероятно, объяснимо усиленной утилизацией метилглиоксаля при использовании этого лекарственного препарата [36].
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что подавление гипергликемии у больных СД вызывает отчетливый псевдоантиоксидантный эффект и способствует уменьшению характерных для этой патологии проявлений окислительного стресса, заключающихся в ингибировании липопероксидации и увеличении активности антиоксидантных ферментов. Следовательно, дополнительное использование антиоксидантных препаратов при СД, вероятно, может быть столь же малоэффективным, как и при атеросклерозе [38]. Ввиду того что значительно бо'льшая опасность при атеросклерозе и СД исходит из последствий развивающегося карбонильного стресса, будущее в комплексной терапии этих заболеваний принадлежит, вероятно, препаратам, способствующим утилизации накапливающихся дикарбонилов. Имеющиеся данные о возможности утилизации высокотоксичных α-оксоальдегидов с помощью лекарственных средств из класса производных гидразинов [39, 40] открывают перспективы для разработки принципиально новых высокоэффективных препаратов для профилактики и дополнительной терапии атеросклероза и СД. Можно также полагать, что по степени снижения активности эритроцитарной СОД можно косвенно судить об интенсивности накопления дикарбонилов в крови больных СД 2-го типа, вследствие чего этот простой биохимический тест, вероятно, может быть использован для дополнительного контроля эффективности сахароснижающей терапии.
У читателя может возникнуть резонный вопрос: если данные большинства экспериментальных и ряда клинических исследований убедительно свидетельствуют о важной роли окислительного стресса в этиологии и патогенезе атеросклероза, почему до сих пор не имеется научно обоснованных клинических рекомендаций для подавления нежелательных окислительных процессов у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и атеросклерозом? Ответ на этот вопрос не может быть однозначным. Частично аргументы и «странные» методы ведения научной полемики противниками свободнорадикальной теории атеросклероза рассмотрены нами в предшествующем обзоре [38]. В связи с этим в настоящем обзоре мы попытаемся проанализировать обоснованность критических высказываний по этому вопросу с учетом последних данных литературы. Прежде всего, никто из авторов не отрицает потенциально негативную роль процессов СРО в развитии атеросклероза, причем, не вызывает сомнения повышенная атерогенность окислительно модифицированных ЛНП [41—45]. В свете имеющихся данных становится очевидным, что окислительно модифицированные ЛНП участвуют не только в образовании «пенистых клеток» и первичном повреждении стенки сосуда, но также провоцируют развитие дисфункции эндотелия [46—48], вследствие чего вновь поднимается вопрос о необходимости использования антиоксидантов для предотвращения повреждений стенки сосудов [46, 48]. Попытки использования антиоксидантов для уменьшения прогрессирования атеросклероза предпринимались неоднократно, причем в большинстве этих исследований использовали природные антиоксиданты — так называемые витамины-антиоксиданты: витамины Е, С и β-каротин. Не должно вызывать особого удивления, что данные клинических исследований по интервенции антиоксидантов при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, в отличие от результатов, полученных при изучении экспериментального атеросклероза, противоречивы [49—53]. Тем не менее проведенные в начале 90-х годов XX века рандомизированные двойные слепые плацебо-контролируемые исследования выявили, что использование витаминов-антиоксидантов достоверно снижает риск развития ССЗ и кардиальной смертности [38, 54, 55]. Причем в одной из немногих работ, в которой для контроля проводили ангиографические исследования [56], документально подтверждено подавление стенозирования коронарных сосудов у пациентов, получавших колестипол и витамины-антиоксиданты. Работы, выполненные на больших контингентах мужчин (n=40 000) и женщин (n=80 000), продемонстрировали, что регулярное употребление витамина Е в течение нескольких лет даже в сравнительно небольших дозах (60 МЕ/сут) способствует снижению риска возникновения ИБС [55, 57]. Одновременно было отмечено, что повышенное употребление b-каротина и витамина С подобным эффектом не сопровождается, однако у мужчин-курильщиков повышенное употребление b-каротина снижало риск возникновения ИБС [57]. В последующем исследовании, включившем большое число мужчин-курильщиков (n=29 133), которые принимали в течение 5—8 лет витамин Е (75 МЕ/сут) и/или b-каротин (20 мг/сут), не отмечено достоверного увеличения смертности от ССЗ [58]. В исследовании CHAOS (Cambridge Heart Antioxidant Study) более 2000 пациентов с ангиографически подтвержденным диагнозом атеросклероза в течение длительного времени (в среднем около 1,5 года) получали высокие (400—800 МЕ/сут)
дозы a-токоферола [59], при этом введение витамина Е достоверно уменьшало риск возникновения инфаркта миокарда (ИМ), однако этот эффект отмечали не ранее чем через год после начала антиоксидантной терапии [59]. В GISSI-Prevenzione trial, напротив, введение 450 МЕ/ сут витамина Е пациентам, у которых прошло не более 3 мес после развития ИМ, не приводило ни к снижению смертности, ни к уменьшению возникновения частоты новых ИМ или инсультов в течение 3,5 года [60]. В исследовании HOPE (Heart Outcomes Prevention Evaluation Study) установлено, что у более 1500 пациентов с высоким риском развития ССЗ, получавших в течение 4,5 года витамин Е по 400 МЕ/сут, не выявлено достоверного уменьшения числа ИМ, инсультов и фатальных последствий ССЗ [61]. В исследовании SPACE в течение почти 1,5 года наблюдали 196 пациентов с ИБС, которым проводили гемодиализ и терапию с включением 800 МЕ/сут витамина Е [62]. При этом установлено достоверное уменьшение числа осложнений ИБС и, прежде всего, уменьшение числа новых случаев ИМ [62]. В исследовании MRC/BHF Heart Protection Study 20 536 пациентов с ИБС в течение 5 лет получали ежедневно комплекс природных антиоксидантов, содержащий 900 МЕ витамина Е, 250 мг витамина С и 20 мг b-каротина или соответствующее плацебо [63]. В результате исследования у пациентов, принимавших витамины-антиоксиданты, не выявлено достоверного увеличения общей смертности, как и смертности от обострения болезней сосудов, включая ИМ и инсульты [63]. Итак, в определенной части клинических исследований выявлен достоверный положительный эффект применения a-токоферола и других природных антиоксидантов [38]. Тем не менее в ряде клинических испытаний не выявлено статистически значимого действия витаминов-антиоксидантов [38], однако достоверных негативных последствий применения антиоксидантных препаратов также не наблюдали. Таким образом, можно констатировать противоречивость данных по применению витаминов-антиоксидантов в клинических исследованиях, что ставит вопрос о необходимости критического анализа причин неоднозначности полученных результатов. Исходя из структуры проведенных исследований, принципов выбора использованных препаратов и доз антиоксидантов, критериев контроля и оценки биохимических и клинических изменений, представляется очевидным, что результаты подобных весьма дорогостоящих работ a priori не могут дать однозначного ответа на поставленные в них вопросы. В связи с этим можно согласиться даже с высказываниями ярых противников дальнейших исследований по использованию антиоксидантов в кардиологии о бесполезности (если не бессмысленности) дальнейшего продолжения подобных исследований [52, 64] без кардинально новых научно обоснованных подходов к планированию и проведению работ. Именно поэтому, вопреки мнению одного из этих авторов [64], мы полагаем, что данных для «окончательного подтверждения неэффективности антиоксидантных витаминов в профилактике коронарной болезни сердца и ее осложнений» пока еще явно недостаточно. Тем не менее в последнее время все чаще раздаются голоса о необходимости объективных подходов к анализу возможностей использования антиоксидантов в терапии ССЗ [43—45]. Анализируя накопленные в настоящее время данные, можно полагать, что недостатки проведенных клинических исследований по применению антиоксидантов в основном сводятся к тому, что в них:
- использовался весьма ограниченный набор природных антиоксидантов- витамины Е, С и b-каротин (чаще не в виде отдельных веществ, а в различных комплексах), однако в выводах этих работ обычно говорится не о действии конкретных комплексов или витаминов, а о действии антиоксидантов вообще, что неправомерно;
- суточную дозу витаминов-антиоксидантов варьировали в весьма широких пределах (например, диапазон суточных доз витамина Е колебался от 60 до 900 МЕ), причем в большинстве исследований использовали аномально высокие, нефизиологичные дозировки и других антиоксидантов, несмотря на подтвержденную теоретически и экспериментально опасность передозировок этих соединений [65—68] и отсутствие надежных сведений, исключающих проявление отдаленных негативных клинических последствий высокодозовой терапии [69];
- с целью подавления атерогенной окислительной модификации ЛНП при планировании исследований использовали малоэффективный в этом отношении витамин Е, который способен защищать ЛНП от окисления лишь в аномально высоких дозах [69—73], а не природный антиоксидант коэнзим Q, предотвращающий СРО ЛНП in vivo в силу химически и физиологически обусловленного механизма [71, 74];
- оценку эффективности их действия зачастую основывали на суммарных критериях (общая или коронарная смертность, увеличение числа ИМ и инсультов), а не на анализе результатов ангиографических исследований, что не позволяет документально подтвердить или опровергнуть влияние витаминов-антиоксидантов на степень прогрессирования атеросклероза у включенных в трайлы пациентов;
- ни в одном из проведенных исследований не были использованы корректные биохимические тесты, характеризующие изменение интенсивности СРО у конкретных пациентов в процессе антиоксидантной терапии; лишь в некоторых клинических испытаниях [59] определяли содержание витаминов-антиоксидантов в плазме крови, что, однако, не позволяет судить о реальной интенсивности процессов СРО.
Из перечисленного очевидно, что результаты большинства выполненных исследований в связи с указанными недостатками их планирования и выполнения не могут претендовать на окончательное решение проблемы научно обоснованного применения антиоксидантов в комплексной терапии атеросклероза, причем резко негативные выводы, сделанные на основании этих работ отдельными авторами [52, 64, 75], не являются достаточно аргументированными и в настоящее время пересматриваются [45]. Очевидно, что дискуссия по проблеме использования антиоксидантов в кардиологии должна быть продолжена, но решение вопроса зависит от результатов новых клинических испытаний, спланированных с учетом допущенных в предшествующих работах просчетов (см. выше) и выполняемых с использованием биохимических методов контроля интенсивности свободнорадикальных процессов.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта № 14-15-00245 Российского научного фонда.
