Наиболее распространенной теорией атеросклероза в настоящее время является попытка рассматривать атеросклеротический процесс как реакцию на повреждение эндотелия [1—3]. Под повреждением подразумевается не механическая травма эндотелия, а его дисфункция, которая проявляется повышением проницаемости и адгезивности, а также увеличением секреции прокоагулянтных и сосудосуживающих факторов. В качестве наиболее важного повреждающего фактора выступает гиперхолестеринемия, при которой изменяется структура эндотелия: увеличивается содержание холестерина и отношение холестерин/фосфолипиды в мембране эндотелиальных клеток (ЭК), что приводит к нарушению барьерной функции эндотелия и повышению его проницаемости для липопротеидов низкой плотности (ЛНП) [4, 5].
Увеличенная проницаемость эндотелия по отношению к ЛНП зависит от формы и конфигурации ЭК. Нарушение целостности эндотелиальной выстилки интимы артерий может быть вызвано апоптотической гибелью ЭК. Причиной развития апоптоза ЭК при атеросклерозе может быть индукция перекисного окисления липидов и накопления активных радикалов кислорода [6]. В литературе недостаточно раскрыта роль апоптоза ЭК на ранних стадиях атеросклероза, неизвестно на какой стадии развития атеросклеротической бляшки (АСБ) и посредством каких механизмов подключается апоптоз.
Целью данного исследования было изучение морфологических изменений и апоптоза ЭК интимы коронарных артерий (КА) на различных стадиях атеросклероза.
Материал и методы
Исследования проводили на КА, взятых от 52 умерших больных атеросклерозом. КА вскрывали продольно и поперечно, отбирали проксимальный, дистальный и центральный отделы сосуда области поражения. В качестве контроля брали КА лиц (n=10) без сердечно-сосудистой патологии, умерших от несчастных случаев.
Для морфологического исследования готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по Массону, на липиды — по Коссу. При анализе гетерогенности эндотелия и связи ее с тяжестью атеросклероза применяли цитологический и морфометрический методы исследования разных типов ядер ЭК. Для иммуноцитохимического типирования ЭК использовали антитела к фактору Виллебранда, для цитологического исследования препараты окрашивали по Романовскому—Гимзе и по Паппенгейму. В целях выявления апоптоза применяли метод TUNEL с использованием коммерческого набора VasoTACS™ In Situ Apoptosis Detection Kit. При идентификации ЭК с признаками апоптоза в мазках-отпечатках КА также использовали метод TUNEL, исключив этапы депарафинизации в растворе ксилола и обезвоживания в спиртах восходящей концентрации. Оценку стадий атеросклеротического процесса в микропрепаратах КА, окрашенных гематоксилином и эозином и по Массону, проводили методом световой микроскопии при увеличении 100.
Исследование клеточного состава коронарных сосудов проводили при увеличении 400 и 1000 на микропрепаратах, окрашенных гематоксилином и эозином и TUNEL-методом.
Морфометрический анализ цитологических препаратов проводился при помощи программно-аппаратного комплекса «Leica-Qwin». Измерения выполняли на увеличении 1000 в 10 полях зрения по всему периметру каждого препарата. Данные количественного исследования рассчитывали на стандартную единицу площади. Определяли площадь ядра — Sn, фактор формы ядра ЭК — Rn. Фактор формы ядра рассчитывали по степени приближенности объекта к форме круга. Апоптотический индекс вычисляли по TUNEL-позитивным клеткам на 100 клеток внутренней оболочки КА на гистологических микропрепаратах при увеличении 1000.
Результаты
При изучении гистологических препаратов сегментов КА лиц с атеросклерозом на стадии жировых полосок (липоидоза) и липосклероза четко верифицировались гладкие миоциты, ЭК интимы, пенистые макрофаги, лимфоциты, эозинофилы, плазмоциты, сегментоядерные нейтрофилы, фибробласты. ЭК на ранних стадиях атеросклероза чаще характеризовались вытянутым, иногда уплощенным ядром и слабо визуализирующейся цитоплазмой. При выраженном сужении просвета сосуда ЭК интимы КА часто приобретали морфологию ЭК vasa vasorum: вытянутые, палочковидные, резко гиперхромные. Относительно часто встречались ЭК интимы КА с прямоугольными ядрами, располагающимися отдельно или цепочкой на участках неповрежденной интимы.
На стадии атероматоза сохранившиеся ЭК выглядели набухшими, ядра клеток — размытыми, однако цитоплазма имела четко очерченный контур, часто была оксифильной. ЭК на стадии атероматоза отмечались в новообразованных сосудах АСБ. Сохранившиеся ЭК покрышки АСБ были с дистрофическими изменениями: набухшие или пикнотичные ядра, их гиперхромия, вакуолизация цитоплазмы.
При идентификации ЭК с помощью иммуноцитохимического типирования положительно к фактору Виллебранда окрашивалась цитоплазма ЭК как в контрольных препаратах, так и в препаратах лиц с атеросклерозом (рис. 1, см. цв. вклейку).
ЭК при цитологическом исследовании непораженных участков КА, как правило, имели удлиненную или полигональную форму. Клетки располагались в виде пласта или одиночно по всему мазку (рис. 2, см. цв. вклейку).
В мазках на стадии липосклероза ЭК располагались группами и разрозненно. Наблюдалось незначительное увеличение числа двуядерных и голоядерных клеток. Цитоплазма скудная, контуры размыты, границы нечеткие, неровные. На стадии атероматоза ЭК в небольшом количестве представлены группами; среди отдельно расположенных ЭК встречались клетки с гигантскими ядрами, появлялись бобовидные ядра, в которых нередко прослеживалась перетяжка, наблюдались многоядерные клетки (рис. 3, см. цв. вклейку). В большинстве случаев цитоплазма клеток была четко очерчена. Хорошо просматривались 1—2 ядрышка. ЭК в мазках-отпечатках препаратов КА с кальцинозом располагались как разрозненно, так и пластами. Ядра средних размеров с четкими границами. Встречались «голоядерные» ЭК, клетки со слабо окрашенной, часто вакуолизированной цитоплазмой, которая сливалась с фоном. Хроматин в большинстве клеток располагался равномерно, в некоторых ядрах — глыбчато.
Обнаруживались также двуядерные клетки и клетки с ядром бобовидной формы.
При статистическом анализе результатов морфометрического исследования мазков-отпечатков КА выявлены достоверные различия (р<0,05) по площади ядер ЭК в мазках, взятых с участков КА у умерших лиц без сердечно-сосудистой патологии и умерших с атеросклерозом. Достоверных различий по форме ядер ЭК в тех же мазках не наблюдалось (табл. 1).
Анализ полученных результатов показал наличие одно- и двуядерных ЭК на всех стадиях атеросклероза, появление многоядерных ЭК на поздних стадиях атеросклероза в отличие от мазков-отпечатков неповрежденных артерий.
ЭК в мазках группы умерших лиц с атеросклерозом были по большей части дегенеративно изменены, характеризовались большим числом атипичных митозов без разделения цитоплазмы и с частичным делением ядра.
При окрашивании методом TUNEL мазков-отпечатков КА на всех исследуемых стадиях атеросклероза выявлялись ЭК с признаками апоптоза. Обнаруживалось характерное расположение хроматина в виде подковы по периферии ядер ЭК (рис. 4, см. цв. вклейку).
В отдельных случаях TUNEL-позитивно окрашивались ядра и цитоплазма ЭК, цитоплазма при этом приобретала мелкозернистую структуру. Отмечались ЭК с крупнозернистой (мелкоглыбчатой) TUNEL-позитивной цитоплазмой и оксифильным TUNEL-негативным ядром (рис. 5, см. цв. вклейку). Окрашивание цитоплазмы ЭК в мазках-отпечатках, вероятно, свидетельствовало о начале некротических процессов в клетке.
Детекция апоптоза в гистологических препаратах показала наличие TUNEL-позитивных ЭК в интиме КА на стадии липоидоза и липосклероза. На стадии атероматоза отмечались апоптоз сохранившихся ЭК интимы в области АСБ, а также апоптоз ЭК в стенке новообразованных сосудов покрышки. Осложненные АСБ (тромбоз, изъязвления) характеризовались наличием TUNEL-позитивных ЭК в стенке новообразованных сосудов АСБ.
Таким образом, исследование апоптоза как в гистологических препаратах, так и в мазках-отпечатках КА выявляло апоптотически измененные клетки стенки сосуда на различных стадиях атерогенеза.
Исследование апоптоза показало достоверное (р<0,05) увеличение апоптотического индекса ЭК в КА, пораженных атеросклерозом, по сравнению с контролем (табл. 2).
По мере прогрессирования атеросклеротического процесса наблюдалось снижение апоптотического индекса. Уменьшалось число апоптотических ЭК, значимые различия по ЭК интимы наблюдались на стадиях липоидоза и липосклероза по сравнению со стадией атероматоза (р<0,05). На ранних стадиях атерогенных нарушений не отмечалось достоверных различий между числом апоптотических ЭК интимы.
Заключение
Проведенные исследования выявили морфологическую неоднородность эндотелиальных клеток в пораженных атеросклерозом артериях. Наибольшей гетерогенностью отличался эндотелий коронарных артерий на стадиях осложненных атеросклеротических бляшек, где наряду с типичными эндотелиальными клетками встречались многоядерные эндотелиоциты и эндотелиальные клетки с гигантскими ядрами. Выявлены достоверные различия по площади ядер эндотелиальных клеток коронарных артерий у умерших лиц с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии.
Детекция апоптоза в мазках-отпечатках выявила наличие TUNEL-позитивных эндотелиальных клеток как с типичным для апоптоза расположением хроматина по периферии ядер, так и с позитивно окрашенными цитоплазмой и ядром. Это указывает на поздний апоптоз с формированием апоптотических телец либо на некроз эндотелиальных клеток.
Апоптотическая гибель эндотелиальных клеток была наиболее интенсивна на ранних стадиях атеросклероза и значительно уменьшалась по мере прогрессирования атеросклеротического процесса. Выявленные морфологические изменения и апоптоз эндотелиальных клеток обусловливают усиление инфильтрации липидами внутренней оболочки коронарных артерий, нарушая ее проницаемость, усиливают протромбогенные свойства эндотелиальных клеток, что в результате приводит к формированию атеросклеротической бляшки и ее дестабилизации.
