Первый опыт исследования «Интрамиокардиальное множественное прецизионное введение мононуклеарных клеток костного мозга в лечении ишемии миокарда»

Несмотря на успехи в лечении больных с хроничес­кой сердечной недостаточностью (ХСН), смертность при данной патологии в 6—7 раз превышает средние популя­ционные показатели [1, 2]. Еще более пессимистичными выглядят результаты клинико-эпидемиологического иссле­дования «Эпоха», по данным которого выживаемость боль­ных с ХСН I—IV функционального класса (ФК по класси­фикации NYHA) в Российской Федерации за 2000—2002 гг. соответствует показателям 1988—1993 гг. в международных клинических исследованиях [3]. Столь неутешительные результаты заставляют клиницистов искать новые подходы к профилактике и лечению ХСН. Одним из таких методов является интрамиокардиальное введение клеток, обладаю­щих пролиферативным потенциалом.

Последние десятилетия отмечены большими достиже­ниями в реваскуляризации миокарда, а также в раскрытии механизмов атерогенеза. Вместе с тем вопросам восста­новления поврежденного миокарда уделялось значительно меньше внимания вследствие догматического представ­ления о кардиомиоцитах как о терминально дифферен­цированных клетках, потерявших способность к самовос­становлению. Однако открытия последних десятилетий опровергли это положение. Показано, что клетки сердца могут участвовать в восстановлении повреждений, хотя их регенераторная способность ограничена. Усилить процесс восстановления можно за счет пересадки клеток, облада­ющих пролиферативным потенциалом и пластичностью. В настоящее время имеются доказательства того, что ство­ловые клетки костного мозга взрослого человека сохраняют пластичность, позволяющую им дифференцироваться в широкий спектр типов клеток. Давно известна способность стволовых клеток костного мозга к секреции различных факторов роста, принимающих участие в неоваскулогенезе. Кроме того, в многочисленных экспериментах показано, что восстановление функции миокарда может быть достиг­нуто путем повышения функционального резерва кардиомиоцитов реципиента как за счет ингибирования апоптоза и повышения устойчивости к ишемии, так и за счет стиму­ляции процессов неоангиогенеза [4, 5].

Цель нашего исследования — определить возможности использования пересадки мононуклеарных клеток костно­го мозга (МККМ) в условиях прецизионного введения при лечении ишемии миокарда и сердечной недостаточности. Исследование зарегистрировано в базе данных ClinicalTrails. gov 13 мая 2011 г. под названием «Intramyocardial Multiple Precision Injection of Bone Marrow Mononuclear Cells in Myocardial Ischemia» (IMPI).

Материал и методы

IMPI — двойное слепое рандомизированное плацебо-контролируемое исследование по оценке эффективности интрамиокардиального прецизионного введения несорти­рованных МККМ при лечении ишемии миокарда. Наличие группы плацебо отличает наше исследование от ранее опубликованных работ [6—8]. В настоящее исследование включаются пациенты в возрасте 18—69 лет с ХСН II—III ФК ишемического генеза. Все пациенты перенесли (более 6 мес назад) инфаркт миокарда (ИМ) с наличием рубцовых полей и систолической дисфункции левого желудочка — ЛЖ (фракция выброса по Симпсону <35%) по данным эхокардиографии (ЭхоКГ). Невозможность выполнения прямой реваскуляризации миокарда, отсутствие показаний к хирургическому лечению постинфарктной аневризмы ЛЖ, стабильность оптимальной терапии не менее 8 нед, наличие имплантированного кардиовертера-дефибриллятора, отсутствие показаний или наличие противопоказаний к трансплантации сердца, а также подписание информи­рованного согласия служат критериями отбора больных в исследование. Не предполагается участие в исследовании пациентов с клинически значимой сопутствующей патоло-гией. Пациенты, нуждающиеся в хирургической реваскуляризации миокарда и имплантации ресинхронизирующего устройства, будут включаться в исследование через 6 мес после вмешательства.

Общее число участников исследования составит 30 человек. Распределение пациентов в исследуемые группы проводится методом рандомизации на основа­нии случайных чисел, генерированных с помощью ком­пьютерной программы. Для оценки эффективности метода будут использованы такие «конечные точки», как уменьшение числа фиксированных дефектов перфузии по данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) и региональное улучшение сокра­тительной способности миокарда по данным ЭхоКГ. В качестве «вторичных конечных точек» предполагается оценивать сердечно-сосудистую летальность, частоту раз­вития нефатальных ИМ и инсультов, частоту госпитали­заций в связи с прогрессированием ХСН, «комбинирован­ные конечные точки», а также изменения ФК ХСН, ФК стенокардии, пикового потребления кислорода по данным эргоспирометрии и качества жизни пациентов.

Все пациенты, включенные в исследование, про­ходят стандартное лабораторное обследование, в том числе определение липидного состава крови, уровня С-реактивного белка высокочувствительным методом, концентрации N-концевого мозгового натрийуретического пропептида (NT-proBNP), а также электрокардио­графию, холтеровское мониторирование, эргоспиромет­рию, ОФЭКТ и оценку качества жизни с помощью опрос­ника SF-36. Длительность наблюдения после пересадки клеток составляет 1 год.

Аспират костного мозга забирается однократно с помо­щью пункции подвздошной кости под общей или мест­ной анестезией. Общий объем аспирата костного мозга составляет около 120 мл и используется для выделения МККМ с помощью автоматического сепаратора клеток Sepax в изолированной системе CS 900 по протоколу Ficoll. Жизнеспособность клеток оценивается с помощью автома­тического анализатора ViCell XR. Фенотипический анализ (панель CD-маркеров) МККМ проводится на проточном цитометре. Процедура имплантации МККМ (120—150 млн жизнеспособных клеток в концентрации 50 000 кл/мкл сте­рильного солевого раствора Хэнкса — HBSS) или введения плацебо (2,5—3,0 мл стерильного HBSS) проводится под контролем флюороскопии и системы NOGA XP, ее инъ­екционным электродом. Для характеристики вводимого клеточного материала в первой порции аспирата костно­го мозга исследуются свойства мезенхимных стволовых клеток (МСК) in vitro. Культуру МСК получают согласно стандартной технологии [9]. На каждом пассаже для МСК определяют количество клеток, время удвоения популяции, ее пролиферативный потенциал, способность к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях и стадию репликативного старения культуры.

Результаты и обсуждение

В настоящее время в мире проводится 121 исследование по применению стволовых клеток в лечении ишемии мио­карда, 62 закончены или находятся на стадии завершения. В ходе 19 независимых клинических испытаний кардиоло­гическим больным производится пересадка МККМ. В том числе в 2 клинических испытаниях задействована систе­ма картирования/навигации NOGA XP Cardiac Navigation System. Применение этой системы позволяет повысить спе­цифичность проводимых пересадок, что имеет решающее значение [10]. Во всем мире используются около 100 подоб­ных систем, в том числе две на территории Российской Федерации.

В качестве кандидатов для проведения регенераторной терапии рассматриваются пациенты 3 категорий: с острым ИМ с подъемом сегмента ST; со стабильной стенокардией высокого ФК и сохраненной сократительной способностью миокарда; с систолической дисфункцией миокарда ишеми­ческого генеза и застойной сердечной недостаточностью. Единого мнения об оптимальном характере биологичес­кого материала, дозах, кратности и методе введения пока не достигнуто. Для оценки эффективности метода важным представляется наличие контрольной sham-оперированной группы, так как в результатах плацебо-контролируемых исследований отмечен положительный эффект плацебо. Установлено, что повреждение миокарда является стиму­лирующим фактором для запуска регенеративных процес­сов. Этот эффект десятилетиями успешно используется в рамках непрямой реваскуляризации миокарда в качестве самостоятельного метода или как способ подготовки к коронарному шунтированию [11, 12]. В настоящее время этот метод применяется у наиболее тяжелого контингента больных с дистальной формой поражения коронарных артерий, когда невозможно выполнить коронарное шун­тирование. Новым шагом в решении этой проблемы стало интраоперационное использование лазерной фенестрации при коронарном шунтировании.

Все имеющиеся данные об эффективности применения стволовых клеток в лечении повреждений миокарда ука­зывают на улучшение клинического течения заболевания. Однако влияние регенераторной терапии на выживаемость пациентов, гемодинамические показатели и морфологи­ческие изменения остается неясным. Результаты ранее проведенных исследований подтверждают, что клеточная терапия оказывает положительное влияние на процессы обратного ремоделирования миокарда [6—8, 13]. Вместе с тем необходимы дальнейшие исследования, которые смог­ли бы ответить на основные вопросы, связанные с исполь­зованием стволовых клеток: идеальный источник и метод получения клеточного материала, оптимальный метод его доставки, кратность введения биологического материала, зависимость клинического эффекта от дозы стволовых клеток, влияние основных свойств стволовых клеток на клинический эффект и т.д.

Первый пациент, включенный в клиническое иссле­дование IMPI (присвоен индекс NM-001), был частично «открыт» со стороны исполнителей с целью оценки аспек­тов безопасности протокола. Пациент — мужчина 62 лет с ишемической болезнью сердца, постинфарктным кар­диосклерозом (Q-ИМ в переднеперегородочной области в 1996 г.), гипертонической болезнью III стадии, риск 4, постоянной формой фибрилляции предсердий, ХСН II ФК по классификации NYHA. В анамнезе аортокоронарное шунтирование в 1997 г. (шунты к правой коронарной и огибающей артериям), пластика аневризмы ЛЖ и имп­лантация трехкамерного кардиовертера-дефибриллятора СРТ-D в 2009 г. по поводу межжелудочковой диссинхронии, полной блокады левой ножки пучка Гиса, нарушения атриовентрикулярного проведения, желудочковой экстрасистолии IV класса, неустойчивой желудочковой тахикар­дии. Данные инструментального и лабораторного обсле­дования представлены в табл. 1. По данным коронарографии показания к повторной реваскуляризации миокарда отсутствовали.

Таблица 1. Данные инструментального и лабораторного обследования пациентаNM-001.

Примечание. ЭхоКГ — эхокардиография; ЛЖ — левый желудочек; КДР — конечный диастолический размер; КДО — конечный диастолический объем; МЖПд — межжелудочковая перегородка в диастолу; ЗСд — задняя стенка в диастолу; TAPSE — амлитуда движения кольца трикуспидального клапана в систолу; TRp — градиент давления на трикуспидальном клапане; ФВ — фракция выброса; КСР — конечный систолический размер; ПЖ — правый желудочек; VO₂max — максимальное потребление кислорода; HR/VO₂ — прирост частоты сердечных сокращений во время нагрузки; ТШХ — тест с 6-минутной ходьбой; СРБ — С-реактивный белок; NT-proBNP — N-концевой натрийуретический пропептид.

Процедура пересадки МККМ проводилась под местной анестезией в условиях рентгеноперационной. Картирование ЛЖ и введение МККМ осуществлялись под контролем флюороскопии и NOGA. Применение навигационной сис­темы NOGA XP являлось основой для успешного прове­дения процедуры. Первым этапом выполняли построение активационной карты ЛЖ, которая давала возможность выявить участки эндокарда с ранней и поздней актива­цией. С использованием возможностей системы NOGA ХР создавали униполярную карту для оценки жизнеспо­собности миокарда и карту локальной сократимости ЛЖ. Сопоставление полученных данных позволяло определить гипо- и акинетичные, но жизнеспособные участки ЛЖ, т. е. участки с электромеханической диссоциацией. Эти участки признавали пригодными для проведения клеточной тера­пии (рис. 1, см. цв. вклейку).

Для проведения клеточной терапии производили заме­ну картирующего электрода на инъекционный. После позиционирования инъекционного электрода в точку интереса выполняли инъекцию МККМ, выделенных из аспирата костного мозга в объеме 120 мл. В 1 мл образ­ца костного мозга от пациента NM-001 содержалось 49607142 МККМ, из них МСК составляли 0,0045%, что соответствовало нормативным значениям (0,01—0,001%). О количестве гемопоэтических стволовых клеток в кле­точном материале свидетельствует уровень жизнеспо­собных клеток CD34⁺CD45⁺, число которых составило 3,97*10⁶или 2,9% от общего числа МККМ. Однократно вводили 0,2 мл клеточной суспензии (50 000 кл/мкл); введение материала осуществляли в течение 60 с. Место инъекции отмечали на карте (см. рис. 1, см. цв.вклейку). Затем выбирали следующую удовлетворяющую крите­риям точку и процедуру повторяли. Осложнений в ходе и после процедуры не отмечено. Ранний и отдаленный послеоперационный период не сопровождался учаще­нием желудочковых нарушений ритма и появлением других серьезных нежелательных явлений. В процессе динамического наблюдения выявлено незначительное увеличение глобальной сократительной способности ЛЖ по данным ЭхоКГ (см. табл. 1). Однако существенных изменений тяжести и распространенности перфузионных дефектов, а также фракции выброса ЛЖ по данным ОФЭКТ не выявлено (рис. 2, см. цв. вклейку).

Несмотря на очевидную тенденцию к увеличению физи­ческой работоспособности пациента по данным теста с 6-минутной ходьбой, показатели эргоспирометрии носят противоречивый характер, что, возможно, связано с изме­нением массы тела пациента в процессе наблюдения или утратой клинического эффекта в отдаленные сроки после интервенционного вмешательства. Резкое снижение индекса массы тела к 6 мес после процедуры пересадки с последующим восстановлением этого показателя может быть объяснено проведением пациенту лапароскопической холецистэктомии, за 1 мес до визита «месяц 6» после пере­садки МККМ.

Исследовать репаративный потенциал нефракционированного костного мозга чрезвычайно сложно из-за немночисленности популяций стволовых клеток и многообразия плейотропных эффектов зрелых клеток костного мозга, поэтому для изучения роли МККМ в неоангиогенезе и репарации миокарда часто используют оценку пролиферативного и дифференцировочного потенциала МСК. Используя культуру МСК, мы выявили, что количество колониеобразующих единиц (КОЕ) сократилось в 5 раз к 4-му пассажу, а это свидетельствует о снижении способнос­ти МСК к самообновлению (рис. 3). Подтверждением дан­ному факту служит увеличение времени удвоения популяции с каждым пассажем. Активность β-галактозидазы в культуре МСК пациента NM-001, указывающая на преждевременное старение клеток, выражена с первого пассажа, что свидетельствует о снижении пролифера­тивного потенциала у больных с сердечно-сосудистой патологией (рис. 4, см. цв. вклейку).

Рисунок 3. Динамика пролиферативного (колониеобразующие единицы, КОЕ) и дифференцировочного (адипо-КОЕ и остео-КОЕ) потенциалов культуры МСК NM-001.

*Р1—Р4 — пассажи клеток; здесь и на рис. 4 МСК — мезенхимальные стволовые клетки.

Наличие в культуре остеогенных и адипогенных кле­ток-предшественников (табл. 2) соответствует характер­ным биологическим свойствам МСК.

Таблица 2. Анализ пролиферативной активности культуры МСК пациента NM-001.

Примечание. МСК — мезенхимальные стволовые клетки; КОЕ — колониеобразующие единицы. Представлены результаты анализа пролиферативной активности культуры МСК пациента NM-001 на каждом пассаже (Р0-Р1) в виде процента КОЕ в популяции, способности к дифференцировке в адипоцитарном направлении (адипо-КОЕ), остеогенном направлении (остео-КОЕ), время удвоения количества клеток в культуре на каждом пассаже и стадия репликативного старения культуры по 3-балльной шкале.

Таким образом, клиническое исследование IMPI, первые результаты которого представлены в насто­ящей работе, призвано ответить на следующие воп­росы: какова эффективность введения МККМ по сравнению с плацебо, необходимы ли повторные введения биологического материала, какова их крат­ность, какие характеристики клеточного материала для пересадки определяют его наибольший клинический эффект, и какие данные лабораторного и инстру­ментального обследования могут использоваться для оценки эффективности и безопасности этого метода лечения.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науч­но-технологического комплекса России на 2007—2012 годы» (ГК№ 02.527.11.0007) и гранта 7-й Рамочной Программы ЕС (№ 241558).