Effect of oxidative stress and polymorphism of catalase CAT-262G/A gene on severity of ulcerative colitis


DOI: https://dx.doi.org/10.18565/therapy.2019.3.93-98

Tretyakova Y.I., Bulatova I.A., Shchekotova A.P., Krivtsov A.V.

1) E.A. Vagner Perm State medical University; 2) Federal scientific Center for medical and preventive health risk management technologies, Perm
The aim is to study the features of the antioxidant system (AOS), lipid peroxidation and to evaluate the functional significance of the CAT-262G/A catalase gene polymorphism in the severity of ulcerative colitis (UC) in patients in the Perm region.
Material and methods. 50 patients with UC in the active phase of the disease and 50 healthy donors were examined. The serum levels of catalase, glutathione peroxidase (HLP) and malondialdehyde (MDA) and the catalase gene polymorphism in the-262G/A region were determined.
Results. The study revealed a significant decrease in the levels of antioxidant enzymes in the group of patients with UC in comparison with healthy individuals. The level of catalase was on average 2,74 times lower, and HLP – 2,02 times as compared with the control group (p = 0,0000). The average MDA was 2,82 times higher in UC patients than in the group of healthy individuals (p=0,0007). When the genotypes and alleles of the-262G/A region of the CAT gene were not distributed, there were no statistically significant differences between the compared groups of patients with UC and healthy individuals in the Perm region. However, the minor A allele and the heterozygote GA were significantly more common in UC patients with a high degree of endoscopic activity and severe often relapsing course of UC (χ2=9,53; p=0,002 and χ2=5,59; p=0,01, respectively).
Conclusions. The concentration of MDA increases and the level of catalase and HLP decreases in the active phase of UC. The risk of developing a severe course of UC, prone to frequent relapses and progression, is associated with the carrier of the minor allele A gene CAT-262G/A, which can be taken into account when predicting the nature of the disease and choosing a treatment tactics.

За последнее десятилетие частота встречаемости язвенного колита (ЯК) выросла в 6 раз, при этом заболевание существенно «молодеет» [1].

Причины ЯК до сих пор точно не известны, в их генезе предполагается участие иммунной системы и генетических факторов [2, 3]. В патофизиологии заболевания важную роль играет оксидативный стресс, являющийся сильным иммуномодулирующим фактором. Снижение активности антиоксидантной системы (АОС) способствует повышению активности перекисного окисления липидов (ПОЛ), что в конечном итоге приводит к патологическим изменениям клеточных плазматических мембран [4].

Длительное воспаление кишечника при ЯК связано с чрезмерным образованием активных форм кислорода и азота, обладающих прямым токсическим действием, а также повышением уровня малонового диальдегида (МДА) – конечного продукта ПОЛ [5, 6]. В то же время происходит снижение ферментов антиоксидантной защиты супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы, которые призваны ограничивать негативные реакции ПОЛ [7].

В последние десятилетия в мире активно ведутся исследования генов ферментов антиоксидантной системы в формировании предрасположенности к мультифакторным заболеваниям человека. ЯК относится к болезням с генетически гетерогенной комплексной предрасположенностью, в связи с чем в настоящее время активно продолжается поиск генов, ответственных за развитие этой нозологии [8, 9]. Ген каталазы (CAT) расположен на хромосоме 11p13 и делится на 13 экзонов [10]. По данным S. Khodayari еt al., полиморфизм гена CAT в промоторном регионе (C-262T) изменяет выработку каталазы и приводит к ряду заболеваний человека, а генотип 262C/T может быть фактором риска развития ЯК [11].

Данные литературы, оценивающие вклад оксидативного стресса и полиморфизма гена CAT-262G/А в прогрессирование иммунного воспаления в толстой кишке при ЯК, немногочисленны. Сведений о взаимосвязи полиморфизма этого гена со степенью тяжести атаки ЯК и эндоскопическими изменениями недостаточно. Во многом это определило цель нашего исследования – изучить особенности АОС, пероксидации липидов и оценить функциональную значимость полиморфизма гена каталазы CAT-262G/А в тяжести течения ЯК у больных в Пермском крае.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие 50 пациентов (28 мужчин и 22 женщины) с ЯК в стадии обострения и с впервые выявленными формами заболевания. Средний возраст составил 34,34±11,47 лет. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике Пермского государственного медицинского университета им. акад. Е.А. Вагнера Минздрава России (протокол от 28 сентября 2015 г. № 4). У всех пациентов было получено информированное согласие на участие в исследовании.

Набор материала проводили на базе гастроэнтерологического и хирургического отделений ГБУЗ Пермского края «Клиническая медико-санитарная часть № 1» и отделения колопроктологии «Городской клинической больницы № 2» (г. Пермь). Диагноз ЯК устанавливали на основании клинических рекомендаций по диагностике и лечению пациентов с ЯК [12]. Степень тяжести атаки ЯК оценивали по критериям Truelove–Witts (1955), которые основаны на оценке ряда клинических, лабораторных показателей и данных эндоскопического исследования; исходя из совокупности этих критериев, выделяют легкую, среднетяжелую и тяжелую атаки ЯК. Определяли индекс эндоскопической активности (ИЭА) по В. Rachmilewits (1989), согласно которому выделяют IV степени ЭА в баллах [12]. Контрольная группа состояла из 50 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту.

Уровень каталазы в сыворотке крови исследовали при помощи метода М.А. Королюк (1988). Активность глутатионпероксидазы (ГЛП) определяли на фотометре по скорости окисления НАДФН в инкубационной пробе при длине волны 340 нм (Вавилова Т.П., 2010). Концентрацию МДА в сыворотке крови определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой фотометрическим методом. Исследование полиморфизма гена CAT в регионе-262G/А проводили на амплификаторе Real-time CFХ-96 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции SNP-Скрин (ЗАО «Синтол», Москва). Для определения генотипов указанного гена у пациентов с ЯК и здоровых доноров проводилось выделение ДНК из цельной венозной крови, предварительно стабилизированной этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft). Описание количественных данных представляли в виде среднего арифметического (M) и среднего квадратичного отклонения (σ), так как распределение учетных показателей (каталаза, ГЛП и МДА) было нормальным. Для оценки значимости различий независимых групп применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Количественная оценка линейной связи определялась с использованием коэффициента корреляции по Спирмену (r). Для описания соотношения частот генотипов и аллелей исследуемых генов использовался метод χ2. Определение зависимости между изучаемыми качественными признаками проводилось по таблице сопряженности (кросс-табуляции). Сила связи признаков измерялась коэффициентом сопряженности (информативности) Пирсона (Ki). Различия между выборками считались достоверными при значении для р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе исследования было выявлено достоверное снижение уровней антиоксидантных ферментов в группе пациентов с ЯК по сравнению с практически здоровыми лицами. При этом уровень каталазы в среднем был ниже в 2,74 раза, а ГЛП – в 2,02 раза относительно группы контроля (р=0,0000). Средний показатель МДА у больных ЯК оказался в 2,82 раза выше, чем у здоровых участников исследования (р=0,0007) (табл. 1).

Таким образом, ЯК в фазе активного воспаления характеризуется активацией процессов ПОЛ, проявляющихся повышением уровня МДА, и истощением механизмов антиоксидантной защиты со снижением выработки ферментов каталазы и ГЛП.

В ходе корреляционного анализа была выявлена достоверная прямая взаимосвязь ферментов антиоксидантной защиты между собой. Уровень МДА находился в отрицательной достоверной связи средней силы с показателями каталазы и ГЛП. То есть чем выше уровень МДА, тем ниже концентрация ферментов АОС. Также были установлены значимые отрицательные взаимосвязи ферментов АОС и выраженная прямая корреляционная взаимосвязь уровня МДА с тяжестью атаки ЯК. Отмечена обратная связь средней силы между уровнем каталазы, ГЛП и протяженностью патологического процесса в толстой кишке (r=-0,53; р=0,0000 для каталазы и r =-0,60; р=0,00006 для ГЛП). Кроме того, получена сильная прямая связь концентрации МДА с протяженностью воспаления при (r =-0,75; р=0,0000) (табл. 2).

Таким образом, существование достоверной обратной корреляционной взаимосвязи между ферментами АОС и уровнем МДА, а также наличие значимых связей этих показателей с тяжестью атаки ЯК, распространенностью патологического процесса, ИЭА, уровнями скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и C-реактивного белка (СРБ) свидетельствуют об активации ПОЛ и накоплении в ткани толстой кишки токсичных свободных радикалов. Это усугубляет воспалительный процесс и эндогенную интоксикацию.

При изучении распространенности генотипов и аллелей полиморфизма гена CAT в регионе-262G/А у пациентов с ЯК и здоровых лиц в Пермском крае статистически значимых различий между сравниваемыми группами выявлено не было; в обеих группах преобладал генотип GG (рис. 1).

Не было отмечено достоверных различий в частоте встречаемости протективного аллеля G (84,0 и 73,33% соответственно; χ2=2,67; р=0,10; QR=1,91) и минорного аллеля А (16,0 и 26,67% соответственно; χ2=2,67; р=0,10; QR=0,52) гена CAT (G262A) в исследуемых группах.

Для сравнительного анализа уровней каталазы, ГЛП и МДА и оценки функциональной значимости полиморфизма гена CAT в регионе-262G/А в прогрессировании ЯК больные были разделены на две подгруппы с учетом степени тяжести атаки и степени эндоскопической активности (ЭА) по данным ректороманоскопии и фиброколоноскопии.

При оценке у больных ЯК по критериям Truelove–Witts [12] выявлено следующее распределение: легкая атака была отмечена у 12 человек (24%), средней тяжести – у 15 (30%), тяжелая – у 23 (46%).

В I подгруппу (n=27) были включены пациенты с ЯК с легкой и среднетяжелой атакой с редкими рецидивами заболевания, 1–2 степенью ЭА и средним ИЭА 4,03±1,18. Во II подгруппу (n=23) вошли больные с тяжелым непрерывным и часто рецидивирующим течением ЯК, 3–4 степенью ЭА и средним ИЭА 9,05±2,15.

Уровни каталазы и ГЛП у больных ЯК с 3–4 степенью ЭА были значимо ниже, а количество МДА выше, чем у лиц с ЭА 1–2 степени (табл. 3).

Оценка сывороточного уровня каталазы, ГЛП и МДА у больных ЯК может быть информативна для определения степеней ЭА и обсуждения вопросов коррекции терапии.

При оценке встречаемости аллельных вариаций гена CAT-262G/А при разной ЭА ЯК мажорный аллель G (χ2=9,53; p=0,002; QR=6,70) и аллельная пара GG (χ2=5,59; p=0,01; QR=8,73) значимо чаще обнаруживались у пациентов с легкой и среднетяжелой атакой и низкой степенью ЭА, чем в группе с 3–4 степенью ЭА и тяжелой атакой ЯК. Минорный аллель А (28 против 6%) и гетерозигота GА (48 против 11%), напротив, значимо чаще встречались у больных с высокой степенью ЭА и тяжелым часто рецидивирующим течением ЯК при мультипликативной модели наследования (χ2=9,53; р=0,002; QR=0,15 и χ2=5,59; р=0,01; QR=0,14 соответственно). Достоверных различий в частоте встречаемости неблагоприятной гомозиготы АА выявлено не было (p=0,32) (рис. 2).

Следовательно, наличие минорного аллеля А гена CAT-262G/А служит предиктором тяжелого рецидивирующего течения ЯК со склонностью к прогрессированию.

При определении зависимости между изучаемыми качественными признаками по таблице сопряженности (кросс-табуляции) в группе больных ЯК была установлена ассоциация полиморфизма промоторного региона-262G/А гена САТ с уменьшением выработки одноименного фактора каталазы (Ki=0,50; р=0,03), а также с увеличением ИЭА (Ki=0,48; р=0,04), повышением уровня СРБ (Ki=0,50; р=0,028) и наибольшей протяженностью воспалительного процесса в толстой кишке (Ki=0,50; р=0,04).

Таким образом, установленная ассоциация полиморфизма гена САТ в позиции rs1001179 с пониженной экспрессией одноименного фактора в сыворотке крови у больных ЯК может вносить вклад в механизмы регуляции антиоксидантной системы, активацию оксидантных систем и способствует повышению активности ПОЛ в группе носителей. Наши результаты подтверждают данные других исследователей, хотя и в отношении полимофизма в другой позиции, в отношении влияния на течение ЯК [10, 11]. Выявленная взаимосвязь полиморфизма этого гена с СРБ, ИЭА и протяженностью процесса в толстой кишке, а также значимая частота патологического аллеля А у больных с высокой степенью ЭА и тяжелыми обострениями может свидетельствовать о вкладе полиморфизма гена САТ-262G/А в предрасположенность к неблагоприятному течению ЯК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

  1. У больных ЯК в период активного воспаления выявлено значимое снижение концентрации в сыворотке крови каталазы и ГЛП, а также повышение уровня МДА.
  2. Концентрация ферментов АОС была значимо ниже, а уровень МДА выше у пациентов с тяжелым течением и частыми рецидивами ЯК и высокой степенью ЭА. Это может быть использовано для стратификации степени тяжести атаки ЯК в дополнение к определению степеней ЭА.
  3. При распределении генотипов и аллелей региона-262G/А гена CAT в позиции rs1800629 статистически значимых различий между сравниваемыми пациентами с ЯК и здоровыми лицами в Пермском крае выявлено не было. Следовательно, полиморфизм гена каталазы CAT-262G/А не является фактором предрасположенности к развитию ЯК.
  4. Риск развития тяжелого течения ЯК, склонного к частым рецидивам и прогрессированию, ассоциирован с носительством минорного аллеля А гена CAT-262G/А, что должно учитываться при прогнозировании характера течения заболевания и выборе тактики лечения.


Literature



  1. Bruno C., Andre C., Raquel R., Genoile O. Epidemiology, demographic characteristics and prognostic predictors of ulcerative colitis. World J Gastroenterol. 2014; 20(28): 9458–67. doi: 10.3748/wjg.v20.i28.9458

  2. Мохов Е.М., Морозов А.М., Кадыков В.А., Аскеров Э.М., Панова А.В. Маркеры воспаления кишечника (обзор литературы). Верхневолжский медицинский журнал. 2014; 1(17): 103–107.

  3. Magro F., Gionchetti P., Eliakim R., Ardizzone S., Armuzzi A., Barreiro-de Acosta M. et al. Third European Evidence-based Consensus on diagnosis and management of ulcerative colitis. part 1: definitions, diagnosis, extra-intestinal manifestations, pregnancy, cancer surveillance, surgery, and ileo-anal pouch disorders. Journal of Crohn’s and Colitis. 2017; 6 (1): 649–60. doi: 10.1093/ecco-jcc/jjx008.

  4. Винокурова Л.В., Березина О.И, Дроздов В.Н., Петраков А.В., Нилова Т. В. Значение оксида азота и малонового диальдегида в диагностике активности хронического панкреатита и эффективности его лечения. Лечащий врач. 2011. URL: http://www.lvrach.ru/2011/02/15435121 (дата обращения 24.02.2011)

  5. Rana S.V., Sharma S., Prasad K.K., Sinha S.K., Singh K. Role of oxidative stress & antioxidant defence in ulcerative colitis patients from north India. Indian J Med Res. 2014; 139(4): 568–71.

  6. Циммерман Я.С., Циммерман И.Я., Третьякова Ю.И. Язвенный колит и болезнь Крона: современные представления (часть 1). Дефиниция, терминология, распространенность, этиология и патогенез, клиника, осложнения, классификация. Вестник Клуба панкреатологов. Украинский гастроэнтерологический журнал. 2015; 3(28): 60–65.

  7. Guan G., Lan S. Implications of Antioxidant Systems in Inflammatory Bowel Disease. Biomed Res Int. 2018:1290179. doi: 10.1155/2018/1290179.

  8. Степина Е.А., Хлынова О.В., Туев А.В. Диагностическая и прогностическая значимость маркеров эндотелиальной дисфункции у пациентов с язвенным колитом. Казанский медицинский журнал. 2016; 2 (97): 187–191.

  9. McGovern D.P., Gardet A., Torkvist L., Goyette P. et al. Genome-wide association identifies multiple ulcerative colitis susceptibility loci. Nat Genet. 2010; 4(42): 332–37.

  10. El-Kheshen G., Moeini M., Saadat M. Susceptibility to Ulcerative Colitis and Genetic Polymorphisms of A251G SOD1 and C-262T CAT. J Med Biochem. 2016; 5(3): 333–36. doi: 10.1515/jomb-2016-0002.

  11. Khodayari S., Salehi Z., Fakhrieh As., Aminian S., Mirzae K., Gisomi N. Catalase gene C-262T polymorphism: importance in ulcerative colitis. J Gastroenterol Hepatol. 2013; 28(5): 819–22. doi: 10.1111/jgh.12141

  12. Ивашкин В.Т., Шелыгин Ю.А., Халиф И.Л. и др. Клинические рекомендации Российской гастроэнтерологической ассоциации и ассоциации колопроктологов России по диагностике и лечению язвенного колита. Колопроктология. 2017; 59 (1): 6–30.


About the Autors


Yulia I. Tretyakova, PhD, associate professor of Department of polyclinic therapy of Academician E.A. Wagner Perm State medical University of the Ministry of Healthcare of Russia. Address: 614990, Perm, 26 Petropavlovskaya Str. Tel.: +7 (342) 217-10-31. E-mail: tretyakovayi@gmail.com
Alevtina P. Shchekotova, MD, professor, the Head of Department of clinical laboratory diagnostics of E.A. Wagner Perm State medical University of the Ministry of Healthcare of Russia. Address: 614990, Perm, 26 Petropavlovskaya Str. Tel.: +7 (342) 217-10-31. Е-mail: al_shchekotova@mail.ru
Irina A. Bulatova, MD, professor of Department of clinical laboratory diagnostics of E.A. Wagner Perm State medical University of the Ministry of Healthcare of Russia. Address: 614990, Perm, 26 Petropavlovskaya Str. Tel.: +7 (342) 217-10-31. Е-mail: bula.1977@mail.ru
Alexander V. Krivtsov, PhD, Head of the immunogenetic laboratory of Federal scientific Center for medical and preventive health risk management technologies. Address: 614045, Perm, 82 Monastyrskaya Str. Tel.: +7 (342) 236-86-99. Е-mail: krivtsov@fcrisk.ru


Similar Articles


Бионика Медиа