Role of microRNA in multifactorial connective tissue pathology


DOI: https://dx.doi.org/10.18565/therapy.2020.6.35-39

Yalaev B.I., Tyurin A.V., Nurlygayanov R.Z., Khusainova R.I.

1) Institute of biochemistry and genetics of Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences; 2) Bashkir State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russia, Ufa; 3) City clinical hospital No. 21, Ufa
The aim of the research was to study the role of polymorphic variants of microRNA binding sites in key genes of structural proteins and bone tissue homeostasis in the generation of a low level of bone mineral density (BMD) and the osteoporotic fractures occurence in males and females from the Volga–Ural region of Russia.
Material and methods. The polymorphic variants of the binding sites rs1061237 (c. *88T> C), rs9659030 (c. *1183A> G), rs11540149 (c. *1865G> A), rs6854081 (c. *3156T> C), rs1042673 (c. * 811A> G), rs10793442 (c. *332G> T), rs10098470 (c. *1073C> T), rs1054204 (c. *582G> C) and rs1042840 (c. * 949A> G) using DNA sample genotyping techniques in a sample of postmenopausal women and men over 45 years old were studied.
Results. There were fixed significant associations of the * A allele of the rs11540149 polymorphic locus (c. * 1865G> A) of the VDR gene with osteoporotic fractures and low bone mineral density in the general sample of males, * G * G genotype of the rs6854081 locus of the FGF2 gene with fractures in the general sample of females and females of Tatar ethnicity, allele * T of locus rs10098470 of TPD52 gene with fractures in females of Russian ethnicity, allele * A of locus rs10793442 (c. * 332G> T) of gene ZNF239 with osteoporosis and osteopenia in the general sample of females and genotype * G * G locus rs1054204 of the SPARC gene with fractures and a low level of BMD in the total sample of males with fractures in the total sample of females and females of Tatar ethnicity.
Conclusion. A number of associations demonstrating the significant role of epigenetic factors in the formation of primary osteoporosis in men and women has been identified.

К настоящему времени существует ряд работ, которые посвящены исследованию роли эпигенетических факторов, регулирующих развитие и метаболизм соединительной ткани. Достоверно показано, что определенные изменения в работе эпигенетических модификаторов могут быть связаны с формированием патологии соединительной ткани, такими как дисплазия соединительной ткани, гипермобильность суставов, остеопороз и др. [1].

Одним из наиболее перспективных направлений в этой области является исследование регуляторных микроРНК – ключевого механизма в регуляции экспрессии генов. Показано, что микроРНК могут играть значительную роль в патогенезе соединительной ткани, так как ключевые гены регуляции костного ремоделирования, метаболизма суставов, пролиферации фибробластов и других компонентов соединительной ткани тесно контролируются различными вариантами микроРНК [2]. Однако в то же время практически нет данных о том, каким образом нарушение сродства регуляторных микроРНК с сайтами связывания на матрице ДНК может влиять на проявление фенотипа различных заболеваний соединительной ткани. Неизвестно, какой вклад полиморфизма сайтов связывания микроРНК в развитии патологии соединительной ткани в целом и какой он имеет эффект в формировании различных нозологий в разных генетически дифференцированных популяциях мира.

Остеопороз (ОП) – широко распространенное заболевание соединительной ткани, которое характеризуется уменьшением костной массы, патологическими изменениями структуры костной ткани и, как следствие, повышением риска развития переломов костей с высокой степенью инвалидизации и смертности [3]. Подавляющая часть переломов костей в результате развития остеопороза приходится на возраст старше 40–50 лет. Каждая вторая женщина постменопаузального возраста и каждый третий мужчина старше 50 лет по всему миру подвержены резко повышенному риску развития этого заболевания. Как показывают данные Всемирной организации здравоохранения, уже сегодня ОП диагностирован у более 200 млн человек по всему миру, при этом частота и распространенность заболевания имеют тенденцию к увеличению как из-за возрастания доли пожилого населения планеты, так и вследствие значительного эффекта накопления генетического груза [4]. Согласно подсчетам, в России ОП страдают 14 млн человек (10% населения страны), еще 20 млн имеют остеопению [5].

37-1.jpg (38 KB)Оказалось, что генетические и эпигенетические факторы определяют не только скорость снижения массы и минеральной плотности костной ткани (МПКТ), но также могут иметь сложный и дифференциальный вклад в патогенетические звенья заболевания и посредством разных механизмов влиять как на фенотипическое проявление заболевания, так и причины его развития.

Нами впервые был исследован ряд полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК (как одних из наиболее значимых эпигенетических регуляторов) в генах, ассоциированных с низким МПКТ и риском переломов согласно GWAS-исследованиям и ген-кандидатному подходу:

1. в мРНК структурных генов: COL1A1 (rs1061237), COL11A1 (rs9659030);

2. в мРНК генов, вовлеченных в метаболизм костной и соединительной ткани: VDR (rs11540149), FGF2 (rs6854081), SOX9 (rs1042673), ZNF239 (rs10793442), TPD52 (10098470), SPARK (1054204), MMP13 (rs1054204).

Цель исследования – поиск ассоциаций полиморфных локусов сайтов связывания микроРНК: rs1061237 (c.*88T>C), rs9659030 (c.*1183A>G), rs11540149 (c.*1865G>A), rs6854081 (с.*3156Т>C), rs1042673 (c.*811A>G), rs10793442 (c.*332G>T), rs10098470 (c.*1073C>T), rs1054204 (c.*582G>C) и rs1042840 (c.*949A>G) с наличием переломов, а также остеопенией, ОП и нормальными показателями МПКТ у мужчин и женщин из Волго-Уральского региона России.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследуемая выборка состояла из 1207 человек из Республики Башкортостан и Свердловской области, среди которых 686 женщин постменопаузального возраста (≈47 лет) и 521 мужчина (≈57 лет). Характеристика групп сравнения представлена в таблице.

37-2.jpg (52 KB)По этническому составу большая часть выборки представлена русскими и татарами, меньшая – представителями других коренных этносов Волго-Уральского региона и метисами (рис. 1 и 2). Выборка разделена на группы сравнения: с переломом/без перелома, ОП с высоким риском перелома (низкий уровень МПКТ), остеопения с повышенным риском переломов (пониженный уровень МПКТ) и норма (нормальный уровень МПКТ). У всех пациентов сформированных групп методом двухфазной абсорбционной рентгеновской денситометрии (DEXA) с использованием аппарата HOLOGIC (США) было проведено измерение МПКТ в стандартных локализациях (аксиальный отдел бедренной кости, поясничный отдел позвоночника, лучевая кость). Также у обследуемых определялась общая костная, мышечная и жировая масса.

Выделение ДНК проводилось посредством фенол-хлороформной экстракции. Концентрация ДНК измерялась с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США). Генотипирование исследуемых образцов выполнялось с использованием системы KASPTM (Kompetitive Allele Specific PCR) – флуоресцентной технологии генотипирования по конечной точке на платформе двух аппаратных систем: QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System и CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System.

Для поиска ассоциаций полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК в таргетных генах с низким уровнем МПКТ и риском переломов была применена таблица сопряженности 2×2 и 2×3 (критерий χ2 Пирсона). Степень ассоциаций оценивалась в значениях показателя отношения шансов odds ratio (OR) по формуле: OR = (a×d)/(b×c), где a – частота признака в выборке больных; b – частота признака в контрольной выборке; с – сумма частот остальных признаков в выборке больных; d – сумма частот остальных признаков в контрольной выборке.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате исследования были получены следующие наиболее значимые результаты: аллель *А полиморфного локуса rs11540149 (c.*1865G>A) гена VDR (рецептора витамина D) оказался ассоциирован с остеопоротическими переломами (p=0,023; OR=1,808; χ2 =5,184) и низким уровнем минеральной плотности костной ткани в общей выборке мужчин (p=0,002; OR=2,393; χ2 =9,726), генотип *G*G локуса rs6854081 (с.*3156Т>C) гена FGF2 (фактор роста фибробластов 2 типа) также оказался связан с переломами в общей выборке женщин (p=0,042; OR=6,88; χ2 =4,152) и женщин татарской этнической принадлежности (p=0,029; OR=9,56; χ2 =4,757), аллель *T локуса rs10098470 (c.*1073C>T) гена TPD52 (ген опухолевого белка D52) ассоциирован с переломами у женщин русской этнической принадлежности (p=0,039; OR=3,64; χ2 =4,262), аллель *А локуса rs10793442 (c.*332G>T) гена ZNF239 (ген белка 239 «цинковых пальцев») с ОП (p=0,041; OR=1,53; χ2 =4,139) и остеопенией (p=0,029; OR=1,67; χ2 =4,714) в общей выборке женщин и генотип *G*G локуса rs1054204 (c.*582G>C) гена SPARC (остеонектин) с переломами (p=0,04; OR=2,70; χ2 =8,125) и низким уровнем МПКТ в общей выборке мужчин (p=0,03; OR=2,18; χ2 =4,713).

ОБСУЖДЕНИЕ

В основе анализа представленных локусов лежит предположение о том, что замена нуклеотида в сайтах связывания мРНК генов с таргетными микроРНК может изменить экспрессию гена и данный механизм может участвовать в формировании ОП. Известно, что изменение последовательности сайта связывания приводит к нарушению сродства микроРНК с целевым участком в мРНК (при участии комплекса RISC-РНК-индуцированного сайлесинга трансляции гена) или нарушению сродства с целевым участком в регуляторной последовательности самого гена (при участии комплекса RITS-РНК-индуцированного сайлесинга транскрипции гена), что в последнем случае приводит к изменению отрицательной регуляции экспрессии гена системой ремоделирования хроматина и метилирования ДНК в регуляторных последовательностях.

Нарушение регуляции экспрессии гена рецептора витамина D может быть закономерно ассоциировано с нарушением регуляции других генов и нарушением регуляции обмена кальция и фосфора. Отмечается, что микроРНК hsa-miR-1260a и hsa-miR-1260b, которые имеют сродство с рисковым аллелем *А, могут быть маркерами ускоренного старения остеобластов [6]. Фактор роста фибробластов связан с широким спектром механизмов регуляции костного метаболизма, в том числе с пролиферацией остеобластов и модуляцией Wnt-сигнального пути, таким образом, рисковый генотип *G*G может быть связан с подавлением экспрессии гена и снижением активности остеобластов [7]. Установлено, что опухолевый белок D52 вовлечен в стимуляцию пролиферации хондроцитов, но не остеобластов, а также то, что нарушение сродства регуляторных микроРНК при рисковом аллеле *Т исследованного полиморфного локуса может привести к усилению пролиферации остеокластов [8]. Ген ZNF239 кодирует белок, являющийся членом семейства транскрипционных факторов типа цинкового пальца, и, хотя функциональный эффект нарушения сродства регуляторных микроРНК с этим геном не известен, вероятно, это приводит к нарушению регуляции генов костного метаболизма. Наконец, ген SPARC кодирует остеонектин, который обеспечивает связывание кальция и взаимодействие компонентов матрикса костной ткани, и можно предположить, что нарушение сродства гена с микроРНК приводит к изменению минерализации кости, а также к нарушению активности металлопротеиназ, участвующих в катаболизме компонентов соединительной ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, обнаружена значимость полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК генов VDR (кодирующем рецептор витамина D), ZNF239 (кодирующем белок, являющийся членом семейства транскрипционных факторов типа цинкового пальца 239), SPARC (кодирующем остеонектин), FGF2 (фактор роста фибробластов 2 типа), TPD52 (ген опухолевого белка D52) с низким уровнем МПКТ и риском возникновения переломов у мужчин и женщин. Это демонстрирует, что при исследовании эпигенетических факторов ОП необходимо учитывать не только изменение паттернов микроРНК, но также нарушение их сродства с сайтами связывания в мРНК, которые могут служить дополнительными факторами риска развития ОП и остеопоротических переломов.


Literature



  1. Chiarelli N., Carini G., Zoppi N. et al. Transcriptome-wide expression profiling in skin fibroblasts of patients with joint hypermobility syndrome/Ehlers–Danlos syndrome hypermobility type. PLoS One. 2016; 11(8): e0161347. doi: 10.1371/journal.pone.0161347.

  2. Гребенникова Т.А., Белая Ж.Е., Рожинская Л.Я. с соавт. Эпигенетические аспекты остеопороза. Вестник РАМН. 2015; 5: 541–548. [Grebennikova T.A., Belaya Zh.E., Rozhinskaya L.Ya. et al. Epigenetic aspects of osteoporosis. Vestnik RAMN. 2015; 5: 541–548 (In Russ.)]. doi: 10.15690/vramn.v70.i5.1440.

  3. Bernabei R., Martone A.M., Ortolani E. et al. Screening, diagnosis and treatment of osteoporosis: a brief review. Clin Cases Miner Bone Metab. 2014; 11(3): 201–07.

  4. Капланова З.А., Шамов И.М., Сутаева Т.Р. Стоматологические пациенты и факторы риска остеопороза у них. Известия Дагестанского государственного педагогического университета. 2015; 2: 83–85. [Kaplanova Z.A., Shamov I.M., Sutaeva T.R. Dental patients and their risk factors for osteoporosis. Izvestiya Dagestanskogo pedagogicheskogo universiteta. 2015; 2: 83–85 (In Russ.)].

  5. Безлюдная Н.В. Актуальность проблемы остеопороза. ФГБУ «Федеральный центр травматологии, ортопедии и эндопротезирования» Минздрава России. [Электронный ресурс]. URL: http://www.orthoscheb.com/upload/1.pdf (дата обращения – 05.08.2019). [Bezlyudnaya N.V. The urgency of the problem of osteoporosis. Federal Center for traumatology, orthopedics and endoprosthetics of the Ministry of Healthcare of Russia. [Electronic resource]. URL: http://www.orthoscheb.com/upload/1.pdf (date of access – 05.08.2019) (In Russ.)].

  6. Chen Y.-J., Chang W.-A., Huang M.-S. et al. Identification of novel genes in aging osteoblasts using next-generation sequencing and bioinformatics. Oncotarget. 2017; 8: 113598–613. doi: 10.18632/oncotarget.22748.

  7. Fei Y., Xiao L., Doetschman T. et al. Fibroblast growth factor 2 stimulation of osteoblast differentiation and bone formation is mediated by modulation of the Wnt signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 2011; 286(47): 40575–83. doi: 10.1074/jbc.M111.274910.

  8. Ito C., Mukudai Y., Itose M. et al. Tumor proteins D52 and D54 have opposite effects on the terminal differentiation of chondrocytes. BioMed Research International. 2017: 6014278. doi: 10.1155/2017/6014278.


About the Autors


Bulat I. Yalaev, 3-year post-graduate student of the laboratory of human molecular genetics at the Institute of biochemistry and genetics of Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences. Address: 450054, Ufa, 71 Oktyabrya Avenue. Tel.: +7 (347) 235-60-88. E-mail: yalaev.bulat@yandex.ru
Anton V. Tyurin, PhD, associate professor, head of the Department of internal diseases of Bashkir State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russia. Address: 450000, Ufa, 2 Shafiev Str. Tel.: +7 (347) 223-11-92. E-mail: anton.bgmu@gmail.com. ORCID: 0000-0002-0841-3024
Radik Z. Nurlygayanov, PhD, traumatologist-orthopedist of City clinical hospital No. 21. Address: 450071, Ufa, 3 Lesnoy Lane. Tel.: +7 (347) 232-32-88. E-mail: radiknur@list.ru
Rita I. Khusainova, doctor of biological sciences, associate professor, professor of the Department of medical genetics and fundamental medicine of Bashkir State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russia, leading researcher of the laboratory of human molecular genetics at the Institute of biochemistry and genetics of Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences. Address: 450054, Ufa, 71 Oktyabrya Avenue. Tel.: +7 (347) 235-60-88. E-mail: ritakh@mail.ru


Similar Articles


Бионика Медиа